参与TuMV复制的不结球白菜寄主因子的筛选及抗病基因功能验证

Turnip mosaic virus (TuMV) is the most prevalent viral pathogen infecting non-heading Chinese cabbage(Brassica campestris ssp. chinensis Makino). TuMV has a relatively small genome and must depend on host factors for replication. Isolation of host factors and subsequently silencing of a host factor gene could lead to the generation of genetic resistance to TuMV. In spite of many recent advances, our current understanding of TuMV replication and virus-host interactions is far from complete. In this research, we isolate the host factors of the TuMV replication complex (VRC) by co-immunoprecipitation with LC-MS/MS and screen the host factors interacted directly with TuMV replication genes by yeast two hybrids in non-heading Chinese cabbage. After these host factors are verified by colocalization, BIFC and yeast two hybrids, we will complete the model of TuMV replication complex. Finally we study the affection on TuMV replication and multiplication after host factors gene silencing. These researches should lead to a better understanding of viral replication and the interactions between host factors and TuMV and might also help develop novel antiviral strategies and potential resistant genes of non-heading Chinese cabbage.

芜菁花叶病毒病(TuMV)是不结球白菜的重要病害，TuMV病毒基因组的复制需要大量的寄主因子参与，分离和克隆这些寄主因子，通过基因工程手段使这些寄主因子基因沉默，可以使寄主产生对病毒的抗性，虽然近年来，对TuMV复制机理以及寄主因子的研究取得了一定的进展，但TuMV与寄主互作的复制机理以及复制复合体模型还远没有研究清楚，因此本研究利用蛋白免疫共沉淀结合质谱分析技术筛选参与TuMV复制复合体的不结球白菜寄主基因，并通过酵母双杂交技术筛选与TuMV复制相关基因直接互作的不结球白菜寄主基因，然后通过基因共定位、BIFC、酵母双杂交等技术验证后，得到参与TuMV复制的不结球白菜寄主基因，总结和完善TuMV复制复合体模型，最后研究参与TuMV复制的寄主基因沉默后对TuMV侵染的影响，探讨TuMV复制与寄主互作机理，发现抗病毒的新策略，并有望获得具有独立知识产权的抗TuMV的不结球白菜新基因。

本项目已全面完成了原计划任务，建立了不结球白菜蛋白复合体免疫共沉淀分离纯化及蛋白质组分析体系，以TuMV::NIb-GFP侵染性克隆侵染的不结球白菜叶片为材料，以GFP抗体捕获TuMV复制复合体，共分离得到12个寄主蛋白；利用TuMV病毒基因组复制相关蛋白NIaPro、Nib和白菜病毒响应基因LRK01为诱饵，利用酵母双杂交技术从不结球白菜感病叶片的cDNA文库中筛选与TuMV病毒基因组复制相关蛋白直接互作的寄主因子，共得到212个主要与病毒复制和运动基本代谢途径相关的寄主因子；利用基因芯片、全基因组分析和基因沉默等技术验证植物SNREs蛋白家族在TuMV侵染过程中的作用，并利用T-DNA突变体和基因沉默验证其在TuMV侵染不结球白菜过程中的作用，为探讨植物-病毒互作机制，改进不结球白菜遗传特性提供了理论依据。发表SCI论文5篇，获授权国家发明专利2件；培养博士研究生3名，硕士研究生4名。