蛋白激酶MAP3K8激活的生化机制

蛋白激酶MAP3K8介导天然免疫细胞比如巨嗜细胞中TNFR,IL1R及Toll-like Receptor(TLR)等信号转导路径中MEK1/2-ERK1/2的激活来调节pro-inflammatory细胞因子（cytokine）、特别是在转录后水平上调节TNFa的的表达。MAP3K8与p105和ABIN-2形成复合体。MAP3K8的激活需要激酶IKK磷酸化p105导致p105的多泛素化（polyubiquitinatination）而降解。p105降解后释放MAP3K8，之后MAP3K8被激活。然而，MAP3K8被激活的机制还有待更多的研究。我们将在体外重建的无细胞MAP3K8激活系统的基础上，通过液相色谱来分离、纯化、鉴定激活MAP3K8的必需分子和条件，并探讨它的激活生化机制。我们还将研究ABIN-2和IKK复合体中NEMO亚基K63多泛素化在调节MAP3K8激活中的作用。

蛋白激酶 MAP3K8 在 TNFR,IL1R 及Toll-likeReceptor(TLR)等炎症和天然免疫信号通路中介导 MEK1/2-ERK1/2 的激活从而在转录后水平上来调节促炎症因子比如 TNFa 的表达。在细胞中 MAP3K8 与 p105 和 ABIN-2 形成三元复合体。虽然 MAP3K8 在天然免疫信号通路中很重要，但是 MAP3K8 被激活的具体机制不清楚，有待更深入的研究。. 在本项目中，我们在体外用无细胞体系重建了 MAP3K8 的激活来模拟细胞内 MAP3K8 的激活情况。将重组蛋白 TRAF6 加入细胞提取物 S100 中，30 °C 温浴一小时，western 检测到 MAP3K8 的下游蛋白 ERK1/2 的磷酸化，表明该体系实现了 MAP3K8 的成功激活。利用该体系，我们使用了经典的高效液相色谱技术来分离、纯化、鉴定激活 MAP3K8 所必需的分子和条件，并初步探讨了它的激活生化机制。这些因子对于激活 MAP3K8 的重要性通过 RNAi 基因敲低技术在细胞水平上进一步得到了验证。一些重要结果概述如下：1）泛素结合酶 Ubc13 是体外 TRAF6 激活 MAP3K8 所必需的；2）IKK 蛋白激酶复合体对于 MAP3K8 的激活是必需的；3）在 Hela 细胞中 ABIN2 对维持 MAP3K8 的稳态表达水平有重要功能；4）线性多泛素化（linear ubiquitination) 介导由 TNF-alpha引起的 MAP3K8 的激活中起着非常重要的调控功能。进一步的深入研究 MAP3K8 激活的生化和分子机制在进行中。. 另外，在执行本项目中，要涉及到另一个重要的蛋白激酶 TAK1。鉴于 TAK1 在天然免疫信号通路中的重要性，我们对 TAK1 的激活机制进行了非常深入的研究。我们发现，1） TAK1 的最 C-端 有一个 Coiled-coil 结构域，而这个结构域对于位于N-端的 TAK1 激酶结构域中关键位点 Thr187 的磷酸化，也就是 TAK1 的激活是必需的；2）TAK1 C-端的一个保守位点 Ser 的磷酸化是TAK1 激活所必需的，而且 蛋白激酶 PKA 家族成员介导了该 Ser 的磷酸的磷酸化。这些结果表明 PKA 参与了TAK1 的激活调控从而参与天然免疫信号通路的调节。