当归四逆汤解痉通脉机制研究

当归四逆汤是治疗血虚寒厥的经方，因寒诱发的血管痉挛疾病疗效确切。但该方究属内皮依赖还是非内皮依赖型血管舒张剂尚不明确。本课题建立TTX处理的大鼠尾动脉痉挛在体模型，预防性给药当归四逆汤，观察在不同局部温度下，使用不同α受体及相关信号通路阻滞、拮抗剂后血流动力学的改变，以排除法筛选该方所抑制的受体和相关信号通路；建立大鼠尾动脉痉挛离体模型，去内皮、阻断?受体，激发预收缩，观察给予该方不同粗提物后，不同温度下血管平滑肌张力，绘制浓度反应曲线，测定寒冷刺激相关的α2C受体表达，探讨该方是否抑制交感神经递质介导的血管收缩；建立反复内皮损伤诱导的冠脉LAD痉挛家猪模型，观察预防性给药后LAD内径、血流动力、血浆ET-1、AFR、抗坏血酸、心肌ROS、损伤心肌微血管组织学、eNOS蛋白表达，探讨该方是否调节内皮损伤引起的ET-1与NO的失衡而发挥解痉通脉作用。预期成果亦可评估该方不同粗提物的药效作用。

当归四逆汤治疗血虚寒厥，对因寒诱发的血管痉挛类疾病疗效确切。本项目旨在探索该方究属内皮依赖型还是非内皮依赖型血管舒张剂，还是两者的共同作用？并评估该方不同提取物的药理效应。研究共分以下步骤：. 1.将该方水提物、以及服用该方的动物血清进行HPLC比照分析，获得相关活性成分。确认服当归四逆汤后入血的成分及其药动学参数。2. 建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，验证预防性服用该方、相关活性成分及其组合（正交设计试验）对模型的有效性。利用正交设计获得的最佳组合，探索该方心脏和心肌微血管内皮细胞保护作用机制。3.建立寒冷诱导的大鼠尾动脉血管痉挛在体模型，确认该方及其提取物去甲乌药碱具有解除尾动脉痉挛作用。并观察去甲乌药碱对低温人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）的PI3K/Akt/AMPK/eNOS/NO信号传导通路、低温人主动脉平滑肌细胞（HASMC）的ROS/ PTK9/α2C-AR信号传导通路影响。4. 建立Wistar大鼠动脉粥样硬化模型，评价当归四逆汤及其活性成分常春藤皂苷元抗AS作用，并从脂质代谢、血液流变学、血管内皮功能及炎症反应等方面探讨其相关作用机制。.结果：1.口服当归四逆汤后，阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、甘草酸、去甲乌药碱、常春藤皂苷元等活性成分均能入血发挥药理效应。2.预防性服用当归四逆汤及其相关活性成分的组合，均能解除冠脉痉挛、因寒诱发的大鼠尾动脉痉挛，增加血流量，对MIRI模型发挥心脏保护作用。其机制是通过IκBα-NF-κB、激活pAkt1/2、pERK1/2、pP70S6K、pGSK3β、Bcl-2等再灌注损伤挽救激酶信号通路（RISK）以及AMPKα、PPARα等信号通路来实现的。4.当归四逆汤及其有效成分组合可升高MIRI大鼠血清中NO，降低再灌注心律失常发生率，改善血流变，降低MMVEC凋亡率。其机制是增强保护性eNOS基因表达和eNOS蛋白磷酸化，抑制损伤性iNOS基因表达和iNOS蛋白合成实现的。5. 当归四逆汤及其活性成分去甲乌药碱，能抑制寒冷诱导的大鼠尾动脉收缩，阻断血管内皮细胞RhoA相关的ET-1表达和血管平滑肌细胞RhoA介导的α2C-AR易位。.结论：寒冷诱导的血管痉挛是内皮依赖型与非内皮依赖型机制相互作用的结果。当归四逆汤能多成分、多途径、多靶点调控血管疏缩。各种活性成分具有一定的分工。