rTMS促进脑缺血后移植的个体化多潜能干细胞源性NPC神经环路重建的研究

Ischemic stroke is a common and frequent disease in clinic, affecting people's health seriously. Individualized iPSC is a cell derived from patients and can proliferate in vitro for a long time, and has more advantages than other cell sources including, avoiding immunological rejection and ethical controversy, so is a novel promising treatment for ischemic stroke. However, the grafts' surviving and differentiation are limited, hence, to improve cell surviving and neural circuits reconstruction is critical to ensure the effects of cell transplantation. Combined with our prevous study, this project aims at treating cerebral ischemia rats with individualized iPSC reprogrammed from tail fibroblasts, as well as with rTMS intervention. Afterwards, we explore whether the motor functions ameliorate from neurobehavioral level, or the surviving, migration and differentiation of the grafts from cellular level, or neural circuits reconstruction (axonal extension, synaptic integration and connections with adjacent nerves) from molecular, tracer analysis and electrophysiological level. And, neural circuits reconstruction via BDNF-TrkB signaling pathway after cerebral ischemia will also be studied, to provide theoretical basis for future clinical application of rTMS combined with iPSC-NPC transplantation.

缺血性脑卒中是临床常见病、多发病，严重危害人们的健康。个体化iPSC移植解决了细胞来源和伦理争议问题，无免疫排斥反应，成为治疗缺血性脑卒中的很有前景的方法，备受关注。然而，脑缺血后移植细胞的存活及分化能力有限，提高细胞存活率和神经环路重建效率，是确保细胞移植治疗效果亟需解决的问题。结合我们的前期研究成果，本项目拟通过鼠尾皮肤成纤维细胞重编程获得个体化的iPSC，并用于移植治疗脑缺血大鼠，同时施加rTMS干预。然后，从动物行为学水平观察脑缺血大鼠的运动功能有无改善；在细胞水平观察移植细胞的存活，迁移及分化；从分子表达，示踪分析和电生理检测层面探索神经环路重建（轴突延伸，突触整合及与周围神经的连接）的情况。并探索BDNF-TrkB信号通路在神经环路重建中的可能作用，为临床运用rTMS联合iPSC-NPC移植治疗缺血性脑卒中提供坚实的理论基础。

目的：探讨rTMS联合人胚胎干细胞来源的神经干细胞（hNSCs)移植对脑缺血大鼠的神经功能改善、rTMS对移植细胞影响及细胞移植后神经环路重建情况。方法：（1）采用单层分化培养方法，在体外将hESCs分化为hNSCs；（2）用免疫荧光的方法检测Foxg1、Sox1、Nestin、Ki67、Map2、Synapsin等标志物的表达；（3）采用线栓法制备脑缺血模型，将造模成功的大鼠进行分组：模型组（vehicle）、细胞移植组（hNSCs）、rTMS干预组（rTMS）、细胞移植和rTMS联合干预组（hNSCs+rTMS），选取纹状体（AP:1.0mm，ML:2.0mm，DV:4.5mm）作为移植点，10HZ，120%RMT的rTMS刺激大鼠M1区；（4）通过抓力计、提尾实验、抓绳实验来检测大鼠的神经行为学；（5）通过免疫荧光检测大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）内源性神经干细胞（NSCs）的增殖、Western blot检测BDNF-TrkB信号通路相关蛋白的表达；（6）利用免疫荧光检测rTMS对hNSCs存活、增殖、分化的影响并进行计数分析，及移植细胞分化成熟、神经环路重建情况。 结果：（1）采用单层分化培养方法，可获得高纯度（>90%）的hNSCs；（2）神经行为学结果发现，rTMS+hNSCs大鼠行为学的改善最为显著，且SVZ区NSCs增殖的细胞数量显著增多、BDNF-TrkB信号通路相关蛋白的表达明显增加；（3）与hNSCs组相比，在rTMS的干预下，hNSCs的存活数量显著增多(P<0.05)，增殖的数量明显减少(p<0.05),但分化为不成熟神经元Tuj1细胞所占比例明显增多(P<0.05)；移植1个月后，分化为成熟神经元NeuN的细胞数量极少，移植3个月后，分化为NeuN的细胞数量增加，并表达突触蛋白Synaptophsin。结论：(1)rTMS+hNSCs治疗效果优于单一的rTMS和（或）hNSCs移植，可能与SVZ区NSCs增殖有关，BDNF-TrkB信号通路也可能发挥了重要作用；（2）在rTMS的干预下，可提高hNSCs存活率、分化率；（3）hNSCs移植后，仍保留分化为成熟神经元和形成神经环路的能力。意义：rTMS对移植的细胞可产生积极作用，在未来rTMS和hNSCs移植联合治疗或许可成为治疗以脑缺血为代表的中枢神经系统退行性疾病一种新的治疗方法。