长牡蛎三类血细胞免疫功能及分子特征的初步探究

The circulating hemolymph of mollusc Pacific oyster is the most primitive type of the complex lymphatic immune system in higher vertebrates, and its cellular immunity plays a pivotal role in the immune defense. So the immune function study of different types of hemocytes in the oyster has not only significant evolutionary significance, but also important practical value for the prevention and treatment of shellfish diseases. Given the great bottleneck that the stable culture of mollusc’s hemocytes and a mature molluscan cell lines is still not available, the present study will mainly focus on three aspects of the Pacific oysters: the isolation, identification and culture of three kinds of hemocytes as the basis; the molecular characteristics of different types of blood cells as the key breakthrough; and the immune function of three kinds of hemocytes as the core. And we will innovatively apply the single-cell transcriptomics, bioinformatics and cellular and molecular immunology techniques to serve our research goals: (1) to establish the technique of three types hemocytes isolation, identification and culture; (2) to reveal the gene transcriptional characteristics and predict the immune function of three types of hemocytes from the molecular level; (3) to clarify the difference of three types of hemocytes about their cellular and humoral immune activity, roliferation and differentiation ability, and their respective functional characteristics in the immune response. These results will provide important reference and guidance for exploring the immune evolution of invertebrates and preventing shellfish diseases.

软体动物长牡蛎的循环血淋巴是高等脊椎动物复杂淋巴免疫系统的最原始类型，其细胞免疫在机体免疫防御中发挥举足轻重的关键作用。因此长牡蛎不同类型血细胞免疫功能的研究不仅具有显著进化意义，对贝类病害防治也具有重要应用价值。鉴于目前软体动物血细胞稳定培养技术尚不完善且无成熟细胞系的困难瓶颈，本研究拟以长牡蛎三类血细胞的分离、鉴定与培养为基础，以其基因表达特征分析及功能预测为突破口，以其免疫功能及应答特征探究为核心关键，创新性地采用单细胞转录组学、生物信息学及细胞与分子免疫学等技术手段，建立三类血细胞的分离与培养方法，揭示三类血细胞的基因转录特征并从分子水平预测其免疫功能，结合实验验证初步阐明三类血细胞的细胞免疫活性、体液免疫活性与增殖分化能力的异同，及其在免疫反应中的应答特征。研究结果将为探究无脊椎动物免疫进化和养殖贝类病害防治提供重要参考和指导。

软体动物血淋巴细胞是高等脊椎动物复杂单核-淋巴免疫细胞的原始类型，其在机体的免疫防御中发挥举足轻重的关键作用。本项目以重要水产养殖品种长牡蛎为研究对象，瞄准其血淋巴细胞的细胞分型、分子特征及免疫功能不明确问题开展研究工作，以其三类群血淋巴细胞的分离、鉴定与培养为基础，利用单细胞转录组学技术解析其基因表达特征并预测其潜在免疫功能，结合实验探究三类群血淋巴细胞的细胞免疫和体液免疫活性及其在免疫反应中的应答特征。经过连续三年的科研攻关，项目研究建立了长牡蛎三类群血淋巴细胞的分类标准与方法，初步阐明了其各自的分子特征及免疫功能，并圆满完成了各项预定目标。项目首先建立了以L15培养基为基础的长牡蛎原代血淋巴细胞体外培养条件，并依细胞直径、核质比、颗粒度等物化指标不同将长牡蛎循环血淋巴细胞分为了三大类群（颗粒细胞、半粒细胞、无粒细胞），明确了不同类群血淋巴细胞的形态特征及分类标准，并建立了分离与培养方法；完成了三类群血淋巴细胞的单细胞转录组学测序与生物信息学分析，解析了其各自的基因表达水平、分子特征及潜在功能，并发现其可能存在线性分化关系；发现了三类群血淋巴细胞在细胞免疫与体液免疫活性上存在显著差异，其中颗粒细胞的吞噬能力、杀菌活性等免疫功能最强，且其细胞数目在病原感染后能显著增加，是发挥免疫防御功能的主要细胞类群。以上研究结果初步阐明了长牡蛎三类血淋巴细胞的分子特征及免疫功能，将为探究无脊椎动物免疫细胞进化和养殖贝类病害防治提供重要参考和指导。项目实施期间取得了多项成果，共发表了SCI收录论文5篇（其中第一标注论文2篇），培养了硕士研究生6名，多名研究生获评“三好学生”荣誉或获得学术报告奖，圆满完成了项目各预定考核指标。