LOX及相关miRNA调节在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成中的作用及机制研究

Cerebral aneurysms formation is a deconstructive remodelling process of vessel wall induced by hemodynamic stress. But the mechanism is unclear. LOX (lysyl oxidase) is an enzyme which can promote the stabilization of the ECM,that plays am important role in keeping the vascular wall intact. And our previous study found that LOX gene and protein increased in the rabbit aneurysm model.So we assume that LOX plays an important role in intracranial aneurysm formation induced by hemodynamic stress.We intends to conduct series of studies around the following pathway: hemodynamic stress - vascular endothelial cells - miRNA - LOX - inflammation or appoptosis - intracranial aneurysm formation. Our main study includes three parts:1)To explore whether LOX is involved in the formation process of intracranial aneurysms or not; 2) Whether and how is LOX regulated by related miRNA and involved in activate the inflammation and apoptosis during the process of aneurysm formation. 3）high hemodynamic stress may regulate the miRNA expression and function of vascular endothelial cells which subsequently regulate the expression of LOX. Through this study, we can clarify the role and regulatory mechanisms of LOX during the process of intracranial aneurysm formation and find potential therapeutic target for non-invasive aneurysm prophylaxis and treatment.

脑动脉瘤是一种血流动力学诱导的脑血管壁结构的破坏性重构，这一观点已获得公认，但机制不明。LOX（赖氨酰氧化酶）是一种能够催化细胞外基质蛋白交叉连接的酶类,这一功能使其在维持血管壁结构的稳定中发挥了重要作用。课题负责人前期在国家自然基金资助下，研究发现脑动脉瘤动物模型中LOX基因及蛋白表达异常，因此我们推测"LOX在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成中发挥重要作用"，拟围绕"血流动力学负荷-血管内皮细胞-miRNA-LOX-炎症或凋亡-颅内动脉瘤生成"这一轴线展开工作。主要研究：1）验证LOX是否参与了颅内动脉瘤的生成过程；2）LOX受相关miRNA的调节激活炎症或凋亡参与颅内动脉瘤生成的分子机制；3）LOX受高血流动力学负荷调节促进颅内动脉瘤生成的血流动力学机制。通过上述研究阐明LOX在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成中的作用和调节机制，为预防颅内动脉瘤的生成和阻断动脉瘤生长提供可能治疗靶点。

动脉瘤性蛛网膜下腔出血约占所有自发性蛛网膜下腔出血的85%左右，严重威胁的人类的健康。其发病凶险，病死率高，然而在通常情况下，很难预测颅内动脉瘤的生长和破裂，对发现和治疗造成了极大的困扰。因此，从动脉瘤发生发展的病理过程入手，研究其发病的分子和细胞机制并探索新的生物学治疗靶点具有重要意义。目前，大量的临床证据及基础研究证据表明，动脉瘤的发生起始于局部血流动力学刺激导致内皮细胞功能障碍。但是内皮细胞是如何感知血流动力学变化，并将力学信号转变为生物学信号，目前并不明确。我们通过对动脉瘤标本和正常血管标本miRNA表达情况进行分析，识别到了miRNA-128、miRNA-29b的上调，miRNA-145的下调，并通过细胞实验进行验证，给予内皮细胞高剪切力刺激时miRNA-128、miRNA-29b上调，miRNA-145下调，同时LOX表达升高，细胞活性降低。采用不同荧光素酶报告系统质粒，发现转染miR-29b激动剂、miR-128激动剂后，荧光强度无明显变化，而转染miR-145激动剂后，携带LOX 3’-UTR区域序列的质粒荧光强度显著升高，而对突变的序列没有效果，说明miR-145可能靶向LOX。通过干扰miRNA-145的表达，发现LOX的表达升高，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测发现细胞凋亡增加，而干扰LOX表达后细胞凋亡减少。结果说明miRNA-145结合LOX 3’-UTR，与脑血管内皮细胞凋亡呈负相关，并通过靶向LOX 3’-UTR对脑血管内皮细胞活性产生影响。进一步对其下游信号通路进行预测，发现过表达LOX，P65和Akt基因表达升高，抑制LOX，P65和Akt基因表达下调，结合KEGG通路预测结果，我们推测LOX可能通过PI3K/Akt、NF-kB通路促进动脉瘤的发生，并进行了验证。最终我们发现高剪切力可以促进LOX的表达，从而促进细胞的凋亡，可能的机制：1、高剪切力抑制miRNA-145的表达，调控LOX的表达；2、LOX蛋白通过AKT和NF-KB通路影响细胞的凋亡及活性。最后我们通过动物实验，发现特异性干扰LOX的表达，可以从一定程度逆转动脉瘤的发生发展。这些研究将有助于阐明动脉瘤的发病机理，为动脉瘤的预防和治疗提供新的实验依据和新的靶点。本项目的研究成果具有潜在的临床应用价值和应用前景。