Ang(1-7)促进内皮细胞TERT线粒体转位减轻重症急性胰腺炎胰腺微循环障碍的作用与机制研究

Pancreatic microcirculatory disturbance is the key pathogenesis of severe acute pancreatitis (SAP), ROS interact with endothelial cells (EC) lead to Microcirculation disturbance is an important feature in SAP. Recent study demonstrated that Angiotensin(1-7) (Ang(1-7)) can reduce ROS by mitochondria telomerase reverse transcriptase (TERT) upregulation in EC. But the main effect of Ang(1-7) in alleviating microcirculation disturbance has not been raised and confirmed. In our present project: (1) Establish the SAP mice models and interfere them with Ang(1-7), Observe vivo microcirculation by microcirculation microscope and pathology of pancreatic tissue, so that to clarify the function of Ang(1-7) alleviate microcirculation disturbance in SAP; (2) Applying for lentivirus interfere TOM20 which is the initiating protein of TERT transposition, in order to explicit the mechanisms of Ang(1-7) to promoted TERT transposition through TOM20/TOM40/TIM23 pathway; (3) Establish TERT over express/knock down SAP modles in vivo and vitro respectively, and determine the mechanisms of Ang(1-7) increasing mitochondria TERT in EC, reducing the production of mitochondria ROS and therefore alleviate the microcirculation disturbance in SAP. Our study will provide experimental evidence for finding out new therapeutic of SAP.

胰腺微循环障碍是重症急性胰腺炎（SAP）重要发病机制，ROS损伤内皮细胞(EC)是微循环障碍的关键因素。我们研究发现Ang(1-7)减轻SAP胰腺出血、坏死等病理改变，胰腺EC存在端粒酶逆转录酶（TERT）。最新证实Ang(1-7)上调EC线粒体TERT，线粒体TERT降低ROS产生。但Ang(1-7)在SAP胰腺微循环障碍中的作用和机制尚不清楚。本研究：①Ang(1-7)干预SAP小鼠，活体微循环检测，明确Ang(1-7)减轻SAP胰腺微循环障碍的作用；②慢病毒转染干扰胰腺微血管内皮细胞TERT线粒体转位起始蛋白TOM20，探究Ang(1-7)促进TERT线粒体转位的分子机制；③Ang(1-7)干预敲低/过表达TERT的SAP小鼠和胰腺微血管内皮细胞，明确Ang(1-7)增加EC线粒体TERT减轻SAP胰腺微循环障碍的作用机制。以期为寻找SAP治疗新靶点提供实验依据。

胰腺微循环障碍是重症急性胰腺炎（SAP）重要发病机制。按研究计划，本项目从以下4个方面展开，（1）Ang(1-7)干预对AP胰腺微循环障碍的作用：采用雨蛙素（CER）联合脂多糖（LPS）诱导小鼠AP模型，应用Moor VMS-LDF激光多普勒血流灌注监测系统监测小鼠胰腺微血管血流灌注量和微血管自律运动，透射电镜观察胰腺组织微血管内皮连续性，内皮细胞线粒体肿胀程度及微血管管径的变化等技术。证实：AP发展中胰腺微循环血流灌注模式降低，微血管自律运动功能障碍，微血管内皮细胞超微结构受损；Ang(1-7)能逆转胰腺微血管自律运动功能紊乱和内皮细胞损伤，减轻AP胰腺微循环功能以及病理损伤。（2）端粒酶逆转录酶（TERT）抑制内皮细胞线粒体活性氧（mtROS）产生和线粒体功能障碍，缓解AP胰腺微血管自律运动损伤：CRISPR技术构建TERT敲低、转基因小鼠，诱导小鼠AP模型；慢病毒转染技术构建稳定的hTERT敲低和过表达的脐静脉内皮细胞系（HUVECs），建立内皮细胞损伤模型。证实：TERT通过抑制mtROS合成和线粒体功能障碍，减轻内皮细胞损伤，缓解胰腺微循环障碍。（3）Ang (1-7)在HUVEC 细胞炎症模型中调控 hTERT 线粒体转位的作用及潜在机制：构建 Tom20 过表达、敲低HUVEC 细胞株及阴性对照细胞，LPS 诱导HUVEC构建内皮细胞炎症模型，Ang (1-7)及Ang (1- 7)/Mas 拮抗剂 A779干预。证实：LPS 刺激HUVEC细胞中，Ang (1–7)促进hTERT线粒体转位；Tom20介导Ang(1–7)促进HUVEC细胞中hTERT 线粒体转位过程；Tom20敲低促进HUVEC细胞中线粒体蛋白Tom40和Tim23的表达。（4）Ang-(1-7)通过TERT抑制内皮细胞氧化应激减轻AP胰腺微循环障碍：采用TERT基因修饰小鼠、hTERT敲低和过表达的HUVECs细胞，证实：过表达TERT促进Ang-(1-7)抑制内皮细胞mtROS合成和线粒体功能障碍的作用，敲低作用相反；Ang(1-7)通过TERT抑制内皮细胞mtROS合成和线粒体功能障碍，减轻内皮细胞损伤，缓解AP胰腺微循环障碍。本课题研究目标已达标，TERT抑制ROS生成的生物学功能及潜在治疗靶点仍在挖掘，拟进一步采用动物、细胞、人群作为研究对象探索其可能的作用和机制。