神经发育分布异常在子宫内膜异位症发病及疼痛中的作用机制研究

本项目拟在已取得的研究工作的基础上建立子宫内膜异位症的大鼠模型，应用免疫组织化学方法研究模型鼠的异位和在位子宫内膜中的神经分布、密度及其种类，并与正常大鼠子宫内膜进行比较；同时给予某些模型鼠抗神经生长因子（Nerve growth factor, NGF）抗体及小RNA干扰（siRNA）抑制NGF基因治疗，比较治疗组和非治疗组模型鼠的症状改变和神经的差异；应用定量PCR和ELISA方法，研究给予治疗的模型鼠及非治疗的模型鼠以及正常小鼠腹腔液中神经生长因子和神经营养因子以及某些生长因子的差异；应用流式细胞术和Tunel等方法，研究治疗组和非治疗组模型鼠在位及异位子宫内膜细胞的增殖和凋亡变化，以探讨抗NGF抗体以及siRNA治疗的机制。本研究预期结果的实现，可以初步阐明神经生长及分布异常在子宫内膜异位症的病因和疼痛产生机制中的作用，进而为子宫内膜异位症的早期诊断以及治疗开辟新的思路和治疗靶点。

目的: 子宫内膜异位症（Endometriosis, EMs）是一种慢性良性的雌激素依赖性的多因素妇科疾病，同时伴有慢性痛经、排尿困难，大便疼痛和性交困难等症状。已有文献结果显示在子宫内膜异位症的异位灶和在位内膜上神经生长因子NGF表达增加，而且参与了调节疼痛感觉的小纤维感觉神经元和交感神经节神经元增生。在此项研究中，我们使用特异性β-NGF 小干扰RNA (β-NGF siRNA)治疗手术诱导的EMs大鼠，旨在进一步探讨一种采用siRNA治疗EMs的方法，降低神经纤维和疼痛的产生。方法: 选择具有动情周期的180~210g的成年雌性Wistar大鼠，自体子宫角异位移植到肠系膜血管手术方法建立EMs模型；将EMs模型鼠随机分为治疗组和对照组；通过蛋白免疫印记分析选择能有效抑制β-NGF 表达的siRNAs，通过基因枪轰击EMs大鼠异位灶，同时，对照组以相同方式转入空质粒；收集两组的血清和腹腔冲洗液的上清液进行ELISA分析β-NGF 表达，同时测量异位病灶大小，异位灶使用免疫组化检测多种神经纤维的表达。结果： 1）成功的建立了子宫内膜异位症模型大鼠，移植的子宫角形成EMs病灶，总的异位灶成活率为55%。异位病灶组织形态相似，呈透明的囊状，囊壁上有时可见小血管，这些囊肿具有自己的交感神经纤维以及C- 和 Aδ-神经纤维。2）通过Western blot方法筛选得到了能有效抑制β-NGF 表达的siRNAs， siRNA基因枪治疗组EMs异位病灶体积减小，血清和腹腔冲洗液中的β-NGF浓度低于对照组（P<0.05），并且改善了全身性痛觉过敏现象；3）siRNA基因枪治疗组大鼠子宫内膜异位灶感觉神经纤维标志SP 和CGRP平均密度的降低，交感神经纤维标志NPY显著性降低。此外，与对照组相比，治疗组有更少的NGF, TrkA, and NGFRp75标记的神经纤维（P<0.05）。 结论：特异性siRNA基因枪治疗介导的β-NGF表达沉默能抑制EMs异位病灶的生长，改善全身性痛觉过敏以及降低交感和感觉神经纤维密度，经过siRNA基因枪治疗，神经纤维的种类而非总的神经纤维的密度发生了变化。