甜菊SrWRKY71转录因子对R-A苷合成关键基因SrUGT76G1的表达调控研究

Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) is a perennial herbaceous plant of Asteraceae, native to South America. Steviol glycosides from stevia plant have characteristics of high sweetness (about 250～450 times of sucrose sweetness), low calorie (calorie is only 1/300 of the sucrose), chemical structure stability and hardly involved in metabolism and so on, and have been used in food, beverage, medicine, chemical industry widely. Rebaudioside A (R-A) is one of two high content components in steviol glycosides, it is more sweet and its sweetness is more close to sucrose. As the most popular natural calorie-free sweetener composition in steviol glycosides by far, the biosynthetic pathway of R-A have always be a research hot spot. However, the metabolism regulation mechanisms of relative genes are not clear, and the research about transcription factors involved in steviol glycosides metabolism regulation is rarely so far. Therefore, based on the researching of the promoter of R-A biosynthesis key gene SrUGT76G1, this project is intent to explore the expression regulation mechanism of SrUGT76G1 by SrWRKY71 transcription factors, by means of the stevia SrWRKY71 transcription factor gene identification, functional verification and screening SrWRKY71 transcription factor interacting proteins. This will lay the foundation for high R-A breeding work by the methods of genetic engineering in future. So it has very important theoretical significance and practical value.

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）为原产南美的菊科多年生草本植物，其植物体所含甜菊糖苷具有高甜度（约为蔗糖的250～450倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）及结构稳定几乎不参与机体代谢等特点，已被广泛应用于食品、饮料、医药、化工等领域。R-A苷为甜菊30多种糖苷组分中的两个大量组分之一，其甜度较高且甜味更接近蔗糖，因此是目前最受欢迎的天然零卡甜味剂。甜菊糖苷特别是R-A苷生物合成途径及关键基因一直是甜菊研究的热点，然而其关键基因的表达调控机制目前尚不明确，转录因子参与甜菊糖苷代谢调控的研究更未见报道。因此，本项目在R-A苷合成关键基因SrUGT76G1启动子研究的基础上，拟通过甜菊SrWRKY71转录因子基因的分离、功能验证、互作蛋白筛选等，探究SrWRKY71转录因子对SrUGT76G1基因的表达调控机制，为后期开展高R-A苷甜菊种质创新等研究奠定理论基础。

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）为原产南美洲的菊科多年生草本植物，其叶片所含甜菊糖苷具有高甜度（约为蔗糖的250～450倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）结构稳定几乎不参与机体代谢等特点，作为天然非营养性甜味剂已被广泛应用于食品、饮料、医药、化工等领域。R-A苷为甜菊30多种糖苷组分中的两个大量组分之一，其甜度较高且甜味更接近蔗糖，因此是目前最受欢迎的天然零卡甜味剂。甜菊糖苷特别是R-A苷生物合成途径及关键基因一直是甜菊研究的热点，然而其关键基因的表达调控机制目前尚不明确，转录因子参与甜菊糖苷代谢调控的研究更是鲜见报道。因此，本项目在R-A苷合成关键基因SrUGT76G1启动子研究的基础上，克隆到甜菊SrWRKY71 转录因子基因，该基因序列含有WRKY结构域，亚细胞定位于细胞核，具有转录激活活性，并且经过EMSA，CHIP和酵母单杂交试验证明SrWRKY71转录因子可与SrUGT76G1启动子直接结合、在烟草叶片中LUC试验结果表明SrWRKY71转录因子抑制SrUGT76G1的表达，进一步在SrWRKY71基因过表达甜菊转基因愈伤中的分析结果再次证明SrWRKY71抑制SrUGT76G1的表达，对甜菊糖苷合成起负调控的作用。综上所述，本项目首次揭示了甜菊糖苷合成关键基因SrUGT76G1的上游调控因子，并基本探明了SrWRKY71转录因子对SrUGT76G1基因的表达调控机制，为今后通过转录因子在转录水平研究甜菊糖苷代谢和开展转录因子调控次生代谢的基因工程等研究奠定基础，具有非常重要的理论意义和实践价值。此外，通过酵母双杂交筛选甜菊cDNA文库得到了一些SrWRKY71互作蛋白序列信息，以及SrWRKY71过表达转基因拟南芥则表现出早花和分枝增多，耐干旱等性状，这些结果则为SrWRKY71转录因子和甜菊糖苷合成调控网络等后续研究提供了新思路。