PD-1/PD-L免疫负调控通路对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后疾病进程的影响

程序性死亡因子（PD-1）及其配体PD-L组成的免疫负调控通路主要调控机体的获得性免疫应答水平。研究发现许多病毒、细菌和寄生虫等引起的慢性持续性感染与PD-1/PD-L通路有关。该通路在PRRSV引起的免疫抑制和持续性感染中是否发挥作用还未见报道。本研究将建立从mRNA水平和蛋白水平检测PD-1、PD-L1和PD-L2表达变化的方法，在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染PAM细胞和体内感染猪后的不同时间点检测不同细胞类型和细胞亚群以及不同靶组织上PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的表达情况，确定PRRSV感染后是否引起PD-1和PD-L表达水平的变化，以及这种变化是否与PRRSV感染后的疾病进程有关，同时比较高致病性变异株和经典PRRSV毒株在干扰和利用PD-1/PD-L通路上是否存在差异。本研究结果将有可能为PRRSV感染导致的免疫抑制和持续性感染机制的研究提供新的思路。

PRRSV感染引起的免疫抑制是造成其持续性感染的主要原因。本课题旨在研究PRRSV感染后对PD-1/PD-L通路的影响，为进一步探讨PD-1/PD-L通路与PRRSV的持续性感染之间的关系奠定基础。主要研究内容包括建立检测猪PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的检测方法，并利用这些方法监测体内、外PRRSV感染后效应细胞和靶细胞上PD-1及其配体的表达变化。主要研究成果如下：1、建立了在mRNA水平检测猪PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达变化的荧光定量RT-PCR方法；2、制备了一株针对猪PD-1分子和两株针对PD-L1分子的单抗，利用这些单抗和流式细胞仪可以在蛋白水平检测这些分子的表达变化；3、用PRRSV感染体外培养的原代PAM细胞，在感染后不同时间点收集细胞，利用荧光定量RT-PCR方法，比较感染细胞与正常培养细胞中PD-L1和PD-L2的表达变化。结果表明，PRRSV HuN4株和CH-1a株在感染后都可引起 PD-L1的表达上调，在感染后60h，上调倍数达到6倍左右。但PD-L2的表达几乎没有变化；4、用PRRSV感染40日龄仔猪，在感染后不同时间点采集PBMC，对PD-1的表达变化进行了监测。利用荧光定量RT-PCR检测的结果表明，PRRSV感染猪PBMC中PD-1的表达在感染后3天就开始上调，HuN4株在感染后7-10天达到高峰，上调倍数约5倍左右，CH-1a株从感染后3天至35天一直处于较高水平。通过流式细胞仪检测PD-1的表达变化与荧光定量RT-PCR结果一致，HuN4株在感染后7-14天，感染猪PBMC中CD4+T细胞和CD8+T细胞上PD-1的表达与对照猪相比都上调了2-3倍，CH-1a株感染后PD-1分子的上调变化持续时间较长。上述结果说明PRRSV感染能够引起PD-1/PD-L通路的改变，至于这种变化的功能意义则需要进行更深入的研究。