生防绿木霉ZBS6拮抗作用的分子机理研究

木霉（Trichoderma.spp.）作为许多植物病原菌的拮抗真菌，在植物病害生物防治领域占有重要地位。目前，国内外研究人员对木霉的研究主要集中于其分类、生物学特性、次生代谢物质分离及产酶特性等研究领域，但对木霉菌的拮抗相关基因及拮抗机制的分子机理却很少有研究。本项目拟选用新型pATMT1双元载体转化拮抗绿木霉ZBS6，通过优化的转化体系，构建高质量T-DNA插入突变体库，并从中筛选拮抗作用显著变异的突变体，克隆相应的拮抗相关基因，通过敲除、互补实验及与病原菌的互作等研究基因功能，探索绿木霉拮抗机制的分子机理。一方面为我国木霉的功能基因组学研究建立平台，为其他木霉真菌以及其他丝状真菌的遗传转化分析提供新的材料和模式，另一方面也为利用绿木霉进行生物防治提供新的思路和策略，为设计和开发新型、低毒、环境友好型的高效生防工程菌杀菌剂奠定理论基础。

木霉（Trichoderma.spp）作为许多植物病原菌的拮抗真菌，在植物病害生物防治领域占有重要地位。目前，国内外研究人员对木霉生物学特性、次生代谢物质分离以及产酶特性等方面均有较为系统的研究，有必要对木霉菌的拮抗相关基因以及拮抗机制的分子机理进行进一步探索和研究，以期设计、开发新型、低毒、环境友好型的生防工程菌杀菌剂奠定理论基础。. 本研究以分离筛选的ZBS6为研究对象，选用pATMT1双源载体对其进行转化，构建了高质量的T-DNA插入突变体库，筛选出拮抗作用显著变异的突变体，并克隆获得相关拮抗基因，进行了后续的基因功能研究。. 1. 优化了农杆菌介导的T-DNA转化技术,建立了绿木霉ZBS6突变体库。转化效率为92转化子/106分生孢子，转化子T-DNA插入率为90.0％，均能够稳定遗传，且T-DNA单拷贝插入率达到80%。通过7次绿木霉ZBS6的T-DNA转化、鉴定及筛选、分析，成功建立了2886个突变体的绿木霉ZBS6突变体库。. 2. 建立了绿木霉ZBS6基因组文库。采用SuperCos1载体构建了绿木霉ZBS6基因组文库。试验中共获得3.9× 104个粘粒克隆，平均插入片段大小为33 kb，文库滴度约为4.2 × 108cfu/ml，从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率理论上可高达99.9％。. 3. 筛选了拮抗作用显著变异的突变体，克隆了相关基因并进行初步基因功能研究。以小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces gramims var. tritici）作为供试病原菌，筛选出T79、T124、T367、T382、T1633和T2192共计6个生防作用显著增强的转化子，经Southern-blot鉴定，仅T79和T1633为单拷贝T-DNA突变体，通过TAIL-PCR及反向PCR等技术，获得了T79和T1633侧翼序列并进行克隆分析，结果表明，T79突变体T-DNA插入标记序列可能是真菌氧化固醇结合蛋白基因；T1633突变体序列为几丁质酶基因。. 4. 初步研究了突变体T1633的基因功能。对T1633突变体T-DNA插入标记的几丁质酶基因cDNA进行克隆、原核表达与活性分析。结果表明，经诱导表达后，获得了47kD的融合蛋白，表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。