DNAH2在范可尼贫血中的作用机制研究

Fanconi anemia (FA) is caused by FA mutation genes, however, known mutation genes are still not detected in five percent of the FA patients. The discovery and study of new FA related mutation gene(s) is a clinical problem that must be solved, due to the correlation between the type of disease and clinical prognosis. Previously, we performed the exome sequencing and subsequent Sanger sequencing analysis in five FA families, and found that DNAH2 point mutations occurred at two patients simultaneously. Function study of the gene demonstrated that, when the expression of DNAH2 was down-regulated, the homologous recombination (HR) repair ratio of DNA and cell proliferation reduced, and FANCD2 failed to be monoubiquitinated. These suggested that DNAH2 is involved in the FA pathway. However, the mechanism of DNAH2 in FANCD2 monoubiquitination remains elusive. Because monoubiquitination of FANCD2 is very important in repopulation of hematopoietic stem cells (HSC), whether the DNAH2 has the same function in HSC as well. Here, we aims at investigating the role of DNAH2 in FANCD2 monoubiquitination and the repopulation of hematopoietic stem cells via the proteomics and induced pluripotent stem cells (iPS) techniques. The study on the role of DNAH2 in the occurrence and development of FA might provide the theoretical basis for the diagnosis and treatment of FA.

范可尼贫血（Fanconi anemia, FA）的发生与FA途径基因突变相关，但目前仍有5%的患者未检测到已知突变基因。由于突变基因类型与预后相关，故发现并研究新的突变基因是临床亟待解决的问题。我们对5个FA家系进行全外显子组测序，发现两位患者同时携带DNAH2突变，初步研究表明：DNAH2敲降后，抑制了DNA的同源重组修复、细胞增殖及FANCD2的泛素化，提示DNAH2参与了FA途径，但DNAH2在FANCD2泛素化过程中的作用机制尚未阐明。另外，单泛素化的FANCD2在维持造血干细胞重建中发挥作用，那么，DNAH2是否亦有此作用仍需研究。故本研究拟以蛋白质组学及相关实验技术对DNAH2在FANCD2泛素化中的作用机制进行研究，并以患者来源的诱导多能干细胞为模型研究DNAH2对造血干细胞重建功能的影响，最终阐明DNAH2在FA发病中的作用机制，为FA的诊断及治疗提供新的理论依据。

范可尼贫血是一种少见的常染色体或X连锁隐性遗传性疾病，是最常见的遗传性骨髓衰竭综合征，主要由相关基因突变所致，最终影响DNA修复过程。我们基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株。回顾性分析临床严重程度及治疗均相同的6例FA患者的临床资料，均采用单细胞凝胶电泳及MMC诱导的染色体断裂试验进行诊断，并采用先天性骨髓衰竭性疾病的基因检测试剂盒或互补实验进行基因分型，最后综合分析FA患者治疗3、6、9、12 个月的临床转归与基因突变的关系。结果发现：6例FA患者中，5例为FANCA型、1例为FANCM型，4例患者携带2种及以上FA基因突变。临床严重程度相同的FA患者中，携带FA突变基因较多的患者发病年龄较小，对药物反应较差，更易发展为重型。同时携带两种以上FA突变基因的患者临床预后较差，应尽早进行造血干细胞移植。此外，我们成功制备针对人DNAH2蛋白的鼠源单克隆抗体。同时我们使用相关抗体及前期所构建细胞系进行了蛋白间相互作用研究，提示DNAH2可能主要通过影响FANCD2泛素化起作用，在受到MMC影响后FA途径虽然激活，但FANCD2未发生泛素化。从临床上初步分析范可尼贫血患儿的临床特征及对不同药物的治疗反应。结果显示，FA患儿的畸形发生率与国际报道不尽相同。FA患儿中并非均有畸形或家族史。FA患儿经环孢菌素A治疗后临床预后差、疾病易进展。我们还利用两种新的FA亚型诊断方法，包括单细胞测序和毛细管纳米免疫测定，研究了FANCMc.4931G>Ap.R1644Q和FANCD1c.6325G>Ap.V2109I的FA情况。成功扩增28个细胞的DNA，Sanger测序后观察到8种细胞。在这种情况下有两个纯合突变（FANCM/FANCD1）。此外，通过NanoPro1000系统进行毛细管纳米免疫测定以检测三种FA相关蛋白的表达谱，包括FANCD2，FANCM和FANCD1。结果表明患者中FANCM和FANCD1的蛋白质异常。因此该病例被诊断为FA-D1/FA-M双亚型。异常的FANCM和FANCD1表达同时存在。与混合细胞测序相比，单细胞测序数据显示更准确的FA亚型评估，而毛细管纳米免疫测定是检测异常或修饰的FA蛋白表达谱的更好方法。