基于ROS-PARP/GAPDH途径探讨滋阴补肾活血法对视网膜微血管周细胞的保护作用研究

Diabetic retinopathy (DR) is the most common complication of diabetes and has very strong blinding, but it is difficult to prevent and cure.Previous study of this research group used "Kidney Deficiency Blood Stasis" as the basic pathogenesis of DR,and the clinical therapeutic effect of prescription for nourishing yin and invigorating kidney and activating blood is effective and unique. Further research found that this formula can inhibit the endothelial progenitor cells VEGF/KDR ring and reduce angiogenesis.Hyperglycemia leads to the production of excess active oxygen free radicals (ROS) in cell mitochondria, resulting in diabetic angiopathy,and VEGF is closely related to ROS;Retinal microvascular pericytes (RMPs) are important regulators of angiogenesis and vascular function and as the first damaged cells in DR, have become a research hotspot. Thus,we propose: Nourishing Yin and Invigorating Kidney and Promoting Blood can play a important role in the treatment of DR by regulating the PARP/GAPDH signal pathway upstream of ROS, down-regulating PARP activity, up-regulating GAPDH activity and inhibiting ROS production and protecting RMPs.This group intends to use HCS, FCM and Laser Confocal techniques to explore the molecular mechanism of nourishing yin and invigorating kidney and promoting blood to treat DR and to reveal its characteristics and rules from the two aspects of in vivo and in vitro and three levels of morphology-function -molecular,which provides new ideas for effective prevention and treatment of DR.

糖尿病视网膜病变（DR）是最常见的糖尿病并发症，具有极强的致盲性，但防治困难。课题组前期研究以“肾虚血瘀”为DR基本病机，采用滋阴补肾活血治法组方，临床疗效独特；进一步研究发现，该方能抑制内皮祖细胞VEGF/KDR环而降低血管新生。高血糖致细胞线粒体产生过量活性氧自由基（ROS），导致糖尿病血管病变，而VEGF与ROS密切相关；视网膜微血管周细胞（RMPs）是血管生成和血管功能的重要调节细胞，在DR中作为首发的受损细胞，已成为研究热点。因此，我们提出：滋阴补肾活血法能通过对ROS上游信号途径PARP/GAPDH的平衡调节，下调PARP活性，上调GAPDH活性，抑制ROS生成，保护RMPs，从而起到治疗DR的作用。本课题组拟采用HCS、FCM、激光共聚焦等技术，从在体-体外两方面、形态-功能-分子三水平，探明滋阴补肾活血方治疗DR的分子机制，揭示其作用特点与规律，为DR有效防治提供新思路。

糖尿病视网膜病变发病机制复杂，传统的单一分子通路研究不能解释后续的基础和临床研究，可能存在着更多因素相互协同或拮抗或上下游因子级联式的庞大网络。基于对目前糖尿病视网膜病变有着统一机制的认识即ROS效应、炎症反应、神经元退行性病变及血糖“代谢记忆”等。尤其对中药复方从ROS-PARP/GAPDH途径影响RMPs的研究，尚未发现相关报道。故本项目在中医理论的指导下，从糖尿病视网膜病变“虚、瘀”病机状态出发，通过体内和体外实验对滋阴补肾活血法（双丹明目胶囊）是否调控 PARP/GAPDH 的平衡，抑制ROS表达，保护视网膜 RMPs展开研究。.（1）双丹明目胶囊对糖尿病大鼠及其视网膜的保护作用.通过注射STZ建立糖尿病视网膜病变大鼠模型，用双丹明目胶囊对其进行干预，结合 PARP 抑制剂、PARP 激动剂、GAPDH 抑制剂、GAPDH 激动剂，采用生化分析、WB、PCR、以及电镜观察，研究滋阴补肾活血法（双丹明目胶囊）通过调节 PARP/GAPDH 平衡，抑制 ROS 生成，保护视网膜 RMPs，从而改善 DR 的分子机制。结果发现双丹明目胶囊可以降低全身血糖水平、纠正血脂代谢紊乱、改善微循环，补充了糖尿病大鼠胰岛素分泌不足的作用。其次，双丹明目胶囊通过通过ROS-PARP/GAPDH信号通路抑制PARP水平，激活GAPDH水平改善糖尿病大鼠缺血、缺氧状态，同时调控自噬途径保护视网膜免受高血糖的影响。.（2）双丹明目胶囊对糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞的保护作用.以H2O2诱导HUVEC体外细胞氧化损伤模型、高糖培养的原代大鼠RMPs为研究载体，结合PARP、GAPDH抑制剂与激动剂，通过体外验证滋阴补肾活血法（双丹明目胶囊）干预ROS-PARP/GAPDH保护视网膜RMPs、改善DR的分子机制。结果表明双丹明目胶囊可以抑制ROS的活性，提高SOD、BCL-2的表达起到抗氧化和抗凋亡作用；同时降低PARP表达，增强GAPDH活性以及调节自噬实现对视网膜周细胞的保护作用。. 主要研究成果是从糖尿病视网膜病变的“统一机制”入手，即ROS效应。运用阻断剂与激动剂，综合采用定性和定量的检测技术， 在形态、结构、功能、分子机制上明确了双丹明目胶囊通过ROS-PARP/GAPDH保护视网膜周细胞的作用。依托本项目发表论文7篇，培养研究生7名，申请专利2项。