基于中药的寒热属性理论研究华蟾素注射液腹腔灌注干预血性结肠癌腹水VEGF表达的机制研究

The preclinical study found that under the guidance of the traditional chinese medicine theory that "treating cold syndrome with heat methods"、"Like curing like",the effect of "damp-heat with exuberance of virulence"colon cancer ascites treated by"cold and toxic"Cinobufagin is significant .It transforms the ascites syndrome from heat to cold,on the basic of inhibiting the growth of ascites and reducing the concentration of red blood cells obviously,but the mechanism is not clear yet. Some researh reported that vascular endothelial growth factor(VEGF) plays a decisive role in the formation mechanism of malignant ascites of colon cancer,it is also reported that Cinobufagin can inhibit the expression of vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), so Cinobufagin maybe at least inhibit the expression of VEGF to achieve the purpose of treating bloody colon cancer ascites. In order to prove our hypothesis，we intend to use the Cinobufagin to intervent the human umbilical vein endothelial cell model and the SW480(highly metastatic human colon cancer cells) colon cancer cell model in vitro, observing the changes of human umbilical vein endothelial cells metabolic, inorder to explore whether the Cinobufagin can inhibit tumor angiogenesis and reduce tumor vascular permeability through the VEGF intracellular signal pathways .Thus we can prove the mechanism under the guidance of the traditional chinese medicine theory.

前期临床观察发现，在中医"热者寒之、以毒攻毒"理论指导下使用"性寒、有毒"的华蟾素注射液腹腔灌注治疗"湿热毒证"的血性结肠癌腹水具有可靠疗效，可在减少腹水量的基础上显著降低血性腹水中红细胞浓度，使"热证"腹水逐渐向"寒证"腹水转化，但上述机制尚未十分明确。研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）在恶性腹水形成中发挥重要作用,而华蟾素注射液具有抑制其受体VEGFR-2表达的作用，所以华蟾素注射液至少是可能通过抑制VEGF表达而达到治疗血性结肠癌腹水目的的。因此，我们拟用华蟾素注射液对人脐静脉内皮细胞模型和荷SW480（高转移性人结肠癌细胞）雌性裸鼠血性腹水模型进行干预，观察干预前后人脐静脉内皮细胞代谢变化及裸鼠腹膜血管内皮细胞结构及功能变化，探讨华蟾素注射液能否干预VEGF细胞内信号通路抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤血管通透性，从而明确"性寒有毒"华蟾素注射液治疗"湿热毒证"血性结肠癌腹水机制。

本研究通过华蟾素注射液对结肠癌血性腹水动物模型和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型、高转移性人结肠癌细胞（SW480）模型进行干预，观察干预前后动物模型腹水、转移瘤和HUVEC、SW480细胞模型的代谢变化，探讨华蟾素注射液能否干预VEGF细胞内信号通路抑制肿瘤血管生成，从而揭示华蟾素注射液治疗结肠癌血性腹水的可能机制。结肠癌血性腹水不仅严重影响患者的生活质量，而且明显缩短生存期，一直是困扰临床医生和患者的问题。前期临床观察发现，在中医“热者寒之、以毒攻毒”理论指导下使用“性寒、有毒”的华蟾素注射液腹腔灌注治疗“湿热毒证”的血性结肠癌腹水具有可靠疗效，可在减少腹水量的基础上显著降低血性腹水中红细胞浓度，使“热证”腹水逐渐向“寒证”腹水转化，但上述机制尚未十分明确。本研究体内实验成功建立荷瘤小鼠结肠癌血性腹水模型，发现随着华蟾素注射液腹腔注射剂量的增高，小鼠腹水量逐渐减少。并通过蛋白质免疫印迹法（WB）和实时荧光定量PCR（RT-PCR）分别从蛋白和基因层面，验证了华蟾素注射液对小鼠肠系膜转移瘤中血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体1（VEGFR-1）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）、VEGF mRNA、VEGFR-1 mRNA、VEGFR-2 mRNA表达的下调作用。体外实验发现，华蟾素注射液能够有效抑制SW480细胞生长、诱导其凋亡；并呈浓度依赖性抑制SW480细胞VEGF、VEGFR-2的表达。另外华蟾素注射液可抑制HUEVC细胞VEGFR-2、VEGF mRNA、VEGFR-1 mRNA和VEGFR-2 mRNA的表达。上述研究结果表明华蟾素注射液治疗结肠癌血性腹水可能与下调VEGF及其受体的表达有关。本研究为推广华蟾素注射液腹腔灌注应用于临床中治疗结肠癌血性腹水提供了实验依据，为华蟾素抗肿瘤的机制研究提供了新思路。未来研究将继续对华蟾素注射液抗肿瘤新生血管作用进一步验证并深入探究其分子机制。