基于高灵敏度共轭聚合物纳米粒子核酸探针的新型癌症干细胞分离方法研究

The evidences are accumulating to support that cancer stem cells (CSCs) are the key of tumor recurrence.Study of CSCs could lead to more efficient anti-cancer therapy and cancer diagnosis. Isolation method limited the research of CSCs now. the key question is how to identifiy CSCs more efficiently. In this proposal,we try to use brightest fluorescent agent, conjugated polymer nanoparticles, as fluorescence reporter and well-known embryonic stem cell and induced pluripotent stem cell maker genes as target to develop molecular beacon probes with high sensitivity, good cellular penetration ability, high selectivity for novel CSCs isolation. This probe will detect the mRNA level of target genes in real-time. By using fluorescence activated cell sorting technique, CSCs will isolated and detected based on stem cells marker genes. Our proposed work will greatly expaned egde of Cancer stem cell markers and could improve the accurcy of the cancer dignosis and accelerate the discovery of new cancer therapy.

癌症干细胞理论指出肿瘤复发与癌症干细胞密切相关。推动癌症干细胞相关研究就可能找到更有效的癌症诊断和治疗手段。目前该领域的研究的瓶颈是癌症干细胞分离手段的限制，关键问题是如何有效识别癌症干细胞。本项目拟采用具有优异荧光性能的共轭聚合物纳米粒子为荧光基团，已知的胚胎干细胞和诱导多能干细胞的标志基因作为靶基因，开发高灵敏度、高细胞渗透性、高特异性的分子信标探针。并使用该探针实时检测癌细胞内标志基因的mRNA表达水平，由此达到癌症干细胞的特异性识别。通过荧光激活的流式细胞分选技术，即可实现癌症干细胞分离和检测。本项目研究将大大推进癌症干细胞的分离，对癌症的诊断与治疗具有重要的意义。

百分之九十的癌症致死病例由癌转移和肿瘤复发造成，癌症干细胞(CSCs)的存在是其关键因素，现有的治疗手段无法有效杀死CSCs。因此研究CSCs的表观基因组学特征是实现癌症早期诊断和治疗的有效途径。目前该领域的瓶颈是缺乏有效的CSCs分离手段，关键问题是找到普适性的癌症干细胞识别手段，以实现简单快速的CSCs分离。本项目执行期间，积极探索了基于硫化氢检测和细胞分裂差异的癌干细胞识别新方法，在此基础上，我们通过代谢标记实现了结肠癌干细胞的准确检测，同时利用代谢标记的办法，结合简单快速的磁分选实现了癌症干细胞的准确快速分离。我们利用带有叠氮基团的天然糖分子的类似物，通过代谢标记将叠氮基团掺入到结肠癌细胞HCT-116中。再通过加入大量的天然糖分子与叠氮糖分子进行竞争；由于癌干细胞的代谢速率相对于癌细胞而言比较慢，所以通过简单的探索天然糖分子的掺入条件，我们就可以使癌干细胞带有叠氮基团而非癌症干细胞不带有叠氮基团，通过加入二苯基环辛炔标记的磁性微球实现了癌干细胞的快速、准确分离。分离得到的癌干细胞种群，我们使用公认的体外表征手段：软琼脂克隆产生效率、肿瘤球生成效率来验证其干细胞特性。分离得到的癌干细胞具有较高的软琼脂克隆产生效率、肿瘤球生成效率。而且还具有结肠干细胞标志物Lgr5 mRNA高表达水平。在另外一个结肠癌细胞系HT-29中也得到了类似的结果，说明方法具有一定的普适性，为结肠癌干细胞的研究提供了必要条件。由于癌症干细胞体外培养分化比较快，我们探索了新型的癌症干细胞体外培养方法。静电纺丝技术是一种简单、高效、低成本的微/纳米纤维制备方法。静电纺丝技术制备的静电纺丝一般为二维结构的薄膜，缺乏复杂的三维结构。我们利用冰球作为模板制备了带有微井结构的三维静电纺丝纤维。微井结构的大小可以通过简单的控制水的体积来实现。细胞培养液滴可以吸附到微井里面，结构本身可以稳定液滴，从而可以用于悬滴法培养肿瘤球。肿瘤球培养是癌症干细胞的一种最常用的体外培养手段，我们建立的方法简单、高效为癌症干细胞的体外培养提供了新的途径。