一个新的水稻脱落酸信号转导相关蛋白OsAPM1的作用与调控机制研究

Abscisic acid (ABA) is an important phytohormone that regulates plant growth, development and abiotic stress responses. ABA transporters or channels play important roles in ABA signal transduction, similar to that happens in auxin signaling pathway. So far how ABA is transported across membrane in planta is poorly understood, especially in monocotyledonous crops. We identified a rice gene OsAPM1 which is likely involved in ABA transportation. It is specifically regualted by ABA signaling pathway and encodes an integral membrane protein, with four transmembrane α-helices within the molecule. The expression pattern of OsAPM1 is strongly correlated with the tissue ABA synthesis activity and ABA level. RNA interference lines of OsAPM1 exhibited reduced drought tolerance and early seed germination phenotypes, while overexpression lines of OsAPM1 showed the opposing phenotypes. Expression of OsAPM1 in yeast enhanced the sensitivity of yeast to exogenous ABA treatment. We propose that OsAPM1 may encode a novel ABA transporter. In this study, we will employ genetic, biochemistry and molecular biology approaches to investigate the function of OsAPM1 and its expressional regulation mechanism. The results will shed light on the understanding of ABA signal transduction process in crops and also provide evidence for clarifying some doubts about ABA transportation in this field.

脱落酸（ABA）是调控植物生长发育和逆境响应的重要激素分子，与生长素类似，其跨膜信号转导也需要转运蛋白或通道的参与，但目前对于ABA跨膜运输机制的了解还很少，特别是在单子叶作物中。我们从水稻中筛选到一个可能与ABA跨膜运输有关的基因OsAPM1，它特异性地受ABA信号途径调控，编码一个具有4个跨膜α-螺旋的膜蛋白，OsAPM1的表达水平与体内ABA合成部位和ABA水平具有强烈关联性。OsAPM1的干扰株系显示抗旱性减弱、种子萌发提前的表型，而过表达株系则呈现相反表型。在酵母中异源表达该蛋白，会显著性增强酵母对外源ABA的敏感性，推测该基因有可能编码了一个新的ABA转运蛋白。本项目中我们将采用遗传、生化及分子生物学手段来研究该蛋白的作用机制，并同时揭示该基因表达的调控机制。研究结果将有利于我们了解作物中ABA信号的传递过程，并为澄清领域中关于ABA转运的疑问提供依据。

ABA激素在植物逆境反应中发挥重要作用，其跨膜转运是ABA信号转导的前提。我们在前期工作中获得了一个受干旱诱导的基因OsAPM1,根据OsAPM1转基因植株的表型、OsAPM1的亚细胞定位及蛋白结构预测等数据推测，OsAPM1可能参与了ABA的跨膜转运。为证实该推测，我们将OsAPM1在酵母中表达，并且利用酵母体系观察了OsAPM1对放射性标记的ABA分子3H-ABA的转运活性，结果发现OsAPM1能够向酵母细胞内转运ABA；采用ABA感受器质粒，即根据ABA与受体蛋白的结合开发的ABA检测载体转化酵母，再进行荧光共振能量转移（FRET）分析，也表明OsAPM1是一个ABA内向转运蛋白；此外，在外源ABA存在下，过表达OsAPM1转基因水稻株系内的ABA积累高于野生型，也支持了OsAPM1向水稻细胞内转运ABA的推测。通过电镜观察，发现干旱胁迫下过表达水稻株系中气孔关闭更快，而RNAi株系则关闭相对较慢；RT-qPCR实验结果表明ABA信号途径的标志性基因在过表达株系中上调，而在RNAi株系中相对下调，这些结果均表明OsAPM1通过向细胞内转运ABA从而参与了气孔关闭调节。为了探索OsAPM1基因的转录调控机制，我们分析了该基因的启动子结构，发现它具有可结合AREB转录因子的ABRE元件。进一步研究发现AREB转录因子OsbZIP46的过表达株系中OsAPM1基因表达上调；利用双荧光素酶报告系统发现OsbZIP46可以增强OsAPM1基因启动子驱动的报告基因表达；凝胶阻滞实验证实OsbZIP46在体外可以直接结合到OsAPM1启动子区域；ChIP-PCR实验结果也证实在水稻体内OsbZIP46可以结合到OsAPM1启动子的ABRE元件富集区，这些结果均表明OsbZIP46是OsAPM1上游的转录调控因子。此外，根据表达模式以及蛋白质互作实验结果判断，AWPM家族中OsAPM2可能与OsAPM1存在功能冗余并能形成异源聚体，但是根据FRET结果，异源聚体的转运活性不如OsAPM1同源聚体，说明OsAPM1仍然是水稻AWPM家族中起主要作用的成员。总之，本项目研究结果表明OsAPM1基因编码了一个新的ABA内向转运蛋白，受到ABA信号途径中重要转录因子OsbZIP46的调控。