基因增强的新型组织工程化阴道修复阴道缺损的研究

采用组织工程化阴道修复阴道缺损的实验研究进展较快，但其临床应用受限的主要原因是组织工程化阴道的血管化及抗感染能力较差。如何加快组织工程化阴道的血管生成以及如何增强其植入体内后的抗感染能力，仍为制约组织工程化阴道临床应用的难题。前期实验已证明抗菌肽LL37可加速组织工程化阴道的血管生成，可提高其抗感染能力。本项目拟以狗的阴道无细胞基质为支架，将转染LL37基因的内皮祖细胞种植于该基质上，使其在此基质上持续高效分泌LL37，通过体外抑菌圈试验和宿主皮下移植检测微循环等指标，定量评价转基因内皮祖细胞分泌的LL37抗感染和促血管生成能力；再将自体阴道上皮细胞和平滑肌细胞种植于该基质的内外表面，体外培养4-5天，构建基因增强的新型组织工程化阴道，用于修复狗全段阴道缺损。探讨LL37在增强阴道组织工程抗感染和血管生成的有效性，为临床功能性组织工程化阴道的制备提供技术支持和实验数据。

本项目拟解决阴道组织工程构建中血管生成差、易感染和组织成活率低等临床应用前的关键问题。课题组充分利用抗菌肽LL37具有较强的广谱抗菌作用，促血管生成和上皮增殖等多重功能，构建具有抗感染能力，能加速血管生成和促进上皮爬行的新型组织工程化阴道，植入修复替代狗长段阴道缺损。课题组成功培养了犬阴道上皮细胞、阴道平滑肌细胞和骨髓间充质干细胞，可获得足够细胞用于阴道组织工程构建。培养的阴道上皮细胞呈典型的铺路石状，未见成纤维细胞混杂，可传代5-6次，特异性角蛋白AE1/AE3抗体染色阳性。阴道平滑肌细胞呈典型的“峰和谷”样，可传代7-8次，平滑肌α-肌动蛋白抗体染色阳性。培养的骨髓间充质干细胞集落成放射状排列，可传代7-8次，流式细胞仪检测高表达CD29、CD44和CD90，而低表达CD34。成功制备了犬阴道无细胞基质和膀胱无细胞基质，HE染色和扫描电镜观察无细胞基质材料由许多排列规则而紧密连接成网状的胶原纤维组成,无细胞碎片。比较了两种无细胞基质生物相容性和修复阴道缺损的可行性，结果表明两种无细胞基质均具有良好的生物相容性和促阴道组织再生，可用于修复阴道缺损。但膀胱无细胞基质来源更广泛，是一种优良的阴道修复材料。成功构建了过表达LL37腺病毒表达载体；包装纯化后腺病毒滴度达到3×109pfu/ mL。转染骨髓间充质干细胞后可持续表达分泌抗菌肽LL37，转染后48h、72h和96h上清液中LL37表达含量分别为对照组的6.8倍、17.9倍和29.7倍。进一步将转基因的骨髓间充质干细胞种植于膀胱无细胞基质表面后埋置于犬背部皮下，通过CD34免疫组化染色证实了转基因骨髓间充质干细胞支架复合物植入体内后能分泌表达LL37，发挥促血管生成作用。进一步体外培养的阴道上皮细胞和平滑肌细胞种植于这种血管活性支架内外表面，构建基因增强的组织工程化阴道修复犬长段阴道缺损。修复后不同时段取材证实新生阴道组织由多层阴道上皮和平滑肌组成，与正常阴道组织无差别，未见狭窄或挛缩，成功修复了犬阴道长段缺损。本项目首次将具有抗感染和促血管生成等多重作用的抗菌肽LL37引入到阴道组织工程构建中，通过加速血管生成和增强抗感染能力提高组织成活率。本项目研究成果不仅为解决其他组织工程的血管化和易感染等关键问题提供借鉴，也为阴道组织工程的临床应用奠定基础。