鸡下丘脑miRNA的差异表达及其靶基因遗传效应分析

miRNA是重要的基因表达调控者，本课题拟在基因表达调控水平，采用solexa高通量测序技术研究不同发育阶段鸡下丘脑组织中miRNA的表达谱，从miRNA的表达谱中筛选出变化最为明显的miRNA，通过实时定量PCR分析验证结果，并利用生物信息学分析相应miRNA的靶基因的结合位点，对这些miRNA结合靶基因的区域在组建好的固始鸡安卡鸡资源群体中进行遗传效应分析。以期阐明miRNA在动物机体生长发育、肉品形成中的调控机制，挖掘出对肉质的基因工程育种的新靶基因，为肉质性状的分子改良提供新的思路和有益的线索。

miRNA是近几年发现的对基因表达进行转录后调控的小分子RNA，通过与靶基因的mRNA 3′非翻译区互补配对参与基因的调控。按照课题任务，采用Solexa技术构建鸡下丘脑不同发育阶段（1日龄和36周龄）miRNA的表达谱。筛选到179个差异表达miRNA，其差异倍数大多集中在1-2倍。其中22个miRNA表达上调，157个miRNA表达下调。采用MIREAP结合Mfold在两个文库中共筛选到363个潜在的新候选miRNA，其中85个在两个文库中都有，112和166个分别在0日龄和成年鸡中特异表达。对179个差异显著的miRNA进行靶基因预测，预测到4362个靶基因，pathway分析结果显示大部分基因参与细胞代谢，和调控细胞代谢相关；GO分析的生物学过程进程表明大部分靶基因与细胞代谢，和调控细胞代谢有关。对筛选到在下丘脑高丰度表达的miR-9、 miR-181a、miR-92、miR-101、let-7a和miR-148等miRNA，采用实时定量PCR的方法分别构建在4个不同时期的表达谱并分别进行功能分析，表明这些miRNA的表达具有组织特异性，大部分在脑部高丰度表达。用TargetScan5.1与PicTar两种在线软件进行靶基因预测，交集的基因集合生物学通路富集分析也表明靶基因在KEGG通路分析中大部分调控功能主要涉及脑发育、神经元分化、神经发生调节和星形胶质细胞分化等生物学过程。对miRNA的靶基因中与肉质等性状有关的基因ADIPOR2、HMGCR、PAX7、PMCH、CFL2、TPRDM16和IL-15等7个基因的遗传效应进行了研究，共筛选到71个SNP位点，用PCR-RFLP等技术对其中的15个SNP在固始鸡安卡鸡F2代资源群中进行群体遗传特性分析。采用生物信息学方法筛选鸡miRNAs种子区的SNPs。在固始鸡-安卡鸡F2代资源群体中检测到3个SNP（gga-miR-1644，gga-miR-1614-3p和gga-miR-1657）。采用PCR-RFLP的方法对这三个SNPs进行分型，并与资源群体的相关经济性状进行关联，并成功构建了鸡miR-1657的pcDNA3.1（+）-pre-miR-1657真核表达载体，采用双荧光报告载体，研究不同基因型对宿主基因RAB38和靶基因的关系，为miR-1657功能研究提供基础。