红麻转非全长HcPDIL5-2a基因雄性不育种质的特征特性与遗传分析

HcPDIL5-2a is a gene related to male sterility, discovered by our research team in kenaf in 2010. When a partial-length HcPDIL5-2a was introduced into a kenaf maintainer line 722B by the pollen-tube pathway method, transgenic male sterile (MS) plants and derivative lines were obtained (we refer the “H” gene-induced MS as to HMS). Since then, four types of HMS lines have obtained by genetic recombination. Interestingly, a thermosensitive HMS line that shows the MS phenotype in the winter of Lingshui in Hainan Provence, but showed a fertile phenotype in the autumn of Nanning in Guangxi Provence has been bred. Further, when HMS line was girdled (ring-barked) in the winter of Lingshui, it also became fertile, demonstrating that the MS phenotype depends on temperature and nutrient supply. In this way, the HMS line can be self-pollinated and maintained in generations. In this project, we investigate the mechanism of microspore abortion in the HMS lines and the effects of girdling and temperature on the MS phenotype in order to classify the HMS lines obtained. Based on the classification of the HMS lines, the genetic inheritance and the relationships between, insertion locus of the “H” gene, expression level and the MS phenotype will be analyzed in order to establish a model of the interaction between the “H” gene and temperature. This research will generate knowledge on the theoretical basis for breeding HMS lines, which is important not only for kenaf, but also for cotton and rice. Meanwhile, the results from this study will also provide insight regarding the molecular mechanism by which the “H” gene produces MS in plants.

HcPDIL5-2a是本团队于2010年在红麻中发现的雄性不育相关基因。利用花粉管通道法将非全长HcPDIL5-2a基因导入红麻，已创造出了雄性不育种质。经过连续5年（2010至2014年）的前期研究工作，已重组出4种类型HMS(以下将转目标基因创制的雄性不育简称为“HMS”），选育出了温敏型（海南冬繁表现不育，南宁夏播表现可育）HMS系；对海南种植的HMS系采用环剥的方法可使其育性恢复，从而实现了HMS系的连续自交。本项目拟观察HMS花药及小孢子的败育特征，分析环剥和温度对HMS育性的效应, 据此对HMS种质进行分类；研究其育性遗传规律及表达量和目标基因插入位点与HMS育性的关系，建立红麻HMS的遗传及其与温度的互作模型。其研究结果不但为红麻HMS系的选育提供理论依据，而且对棉花和水稻等作物HMS系的选育有重要参考价值；同时，为研究目标基因导致雄性不育的分子机理积累基础性资料。

本项目有3项研究内容：（1）观察了不同类型转PH基因创制的核不育种质HMS 花药及小孢子的败育特征： 结果发现，不同类型 HMS 及由此转育而成的 CMS株系的花药及小孢子败育时期均为双核期，败育较晚，且花粉粒外形基本正常，但内容物不足，花药不开裂，为长日高温及环剥诱导育性恢复提供了理论依据。（2）分析了环剥和温度对 HMS 育性的效应：结果表明， 转基因HMS 可分为 4 种类型，环剥及光温对 HMS 的育性表现了不同的效应，花粉内容物不足可能与红麻运输抑制剂响应蛋白 1（TIR1）基因有关。（3）研究了 HMS 育性遗传规律：结果表明，外源基因与 HMS 的不育性表现共分离，不育性为隐性性状；对 HMS 回交转育而成的 CMS 系 722HA 进行的分子鉴定表明，722HA 发生了mt DNA 重排，为雄性不育细胞质；对目标基因“H”及“PH”的克隆与表达分析表明，3 个转 PH 基因株系全为单拷贝，2个转H基因株系中1个株系为2个拷贝。（4）增加了转基因分子机理的研究内容：首先，对红麻进行了mtDNA测序，明确了其结构特征；其次，筛选出了稳定的 CMS 内参基因，为分析转 PH 基因的遗传与表达奠定了基础；第三，转 PH 基因导致 GMS 或者 CMS 的分子机理研究表明， PH 与内源 H 基因竞争同一热激蛋白 HcHsp40，但因 PH 不能催化其形成正确构象而丧失功能，进而导致线粒体过量活性氧(reactive oxygen species, ROS) 积累而诱发 mtDNA 点突变、缺失和插入，形成GMS或CMS。第四，花粉败育时期的转录组比较分析表明，转基因CMS系722HA 的 ROS 清除能力明显的低于其保持系，导致 ROS 过量累积而影响小孢子的正常发育。第五，对转基因GMS突变体内源激素含量测定结果显示，在花粉发育的四分体时期、单核期和双核期时期，不育系 HMS 的 IAA、GA 含量呈下降趋势；而ABA含量上升，由此加速了绒毡层细胞的衰老，从而不能向花粉有效提供营养物质。已发表学术论文4篇，其中SCI论文3篇，还有3篇待发表；申请国家发明专利2件，其中已授权1件；培养博士后2人，博士研究生1人，硕士研究生1人。超额完成了预定计划，实现了预期目标。