通阳活血法对兔缺血再灌窦房结细胞起搏电流及HCN4蛋白磷酸化影响

通阳活血方是老中医刘志明治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征（病窦）的原创方，临床疗效很好，前期研究表明该方能通过多种机制提高窦房结自律性，增强窦房结细胞（SNC）起搏功能，改善病窦患者临床症状。病窦的病理生理基础是SNC变性、结构受损及电生理功能异常，起搏电流（If）对SNC自律性的维持起着关键作用。前期研究已证明该方能提高受损窦房结起搏基因（HCN4）mRNA及蛋白表达。本研究拟以兔缺血再灌注SNC为研究对象，以If为切入点，通过膜片钳、免疫印迹、酶联免疫等技术研究通阳活血方对受损SNC的If及通道蛋白HCN4磷酸化的影响，观察SNC活性及骨架结构改变，从组织、细胞、分子等不同层面对该方作用机制进行深入研究，揭示其逆转病窦的多环节作用整合效应。假设该方能增强SNC的If及HCN4蛋白磷酸化水平、保护SNC结构，将为其治疗病窦提供新的科学依据，对深层次挖掘老中医经验的科学内涵具有重要意义。

病态窦房结综合征（SSS）现今尚无有效根治措施，西医无有效药物治疗，严重者需要植入人工心脏起搏器，尚不能普及。通阳活血方是国医大师刘志明治疗SSS的原创经验方，疗效独特。前期研究表明该方能通过多种机制提高窦房结自律性，增强窦房结细胞（SNC）起搏功能，改善SSS患者临床症状。.研究主要内容：制备通阳活血方含药血清；分离、培养、鉴定乳兔SNC；以缺氧缺糖-恢复氧、糖供应模拟缺血再灌注制备SNC损伤模型；检测通阳活血方含药血清对受损SNC活性、凋亡、骨架蛋白β-tubulin、F-actin、desmin、vinculin以及If通道蛋白HCN4表达及磷酸化水平的影响；同时采用膜片钳技术观察该方对受损SNC If电流的改变。.研究结果：1. 采用差速贴壁法分离培养的乳兔SNC，适用于膜片钳试验。2. 采用缺氧缺糖¬¬-恢复氧、糖供应模拟缺血再灌注制备SNC损伤模型，造模成功，方法可行。3. 模型组活细胞量较正常组明显减少，凋亡明显增多，含药血清组活细胞量明显高于模型组(P<0. 05)，凋亡明显减少(P<0. 01)，空白血清组与模型组无明显差异。4.模型组细胞骨架蛋白裂解明显，平均荧光强度明显低于空白对照组（P<0.01），含药血清高、中剂量组细胞骨架蛋白均较模型组完整，平均荧光强度明显高于模型组（P<0.01），空白血清组与模型组无明显差异。5.该方含药血清增强PKA的蛋白表达（P<0.01），增加HCN4蛋白表达及磷酸化水平（P<0.01）；6.该方含药血清可加快乳兔受损 SNC 自发性搏动频率（P<0.01），缩短作电位时程APD20、 APD50（P<0.01），增大乳兔受损 SNC 的 APA，能电压依赖性增大受损乳兔 SNC 的If电流密度，加快If 通道稳态激活，恢复降低的If电流密度，以缩短 SNC 动作电位的舒张去极，从而提高其自律性。.结论：通阳活血方增强受损SNC活性，抑制细胞凋亡，保护受损SNC细胞骨架结构，通过上调HCN4蛋白磷酸化和增强PKA的蛋白表达，增加If强度和密度，从而增强SNC自律性，加快心率，是通阳活血方治疗SSS的可能机制。.本实验以模拟缺血再灌注损伤乳兔SNC为研究对象，将名老中医治疗SSS的经验与现代实验技术有机结合，在已往研究方法基础上加以创新突破，探讨通阳活血方治疗SSS的深层机制，为防治SSS提供新的思路和理论依据。