利用基因重组技术构建MRSA流行株假体关节感染模型的实验研究

Constructing an animal model of prosthetic joint infection using clinical epidemic MRSA strains is a key tool of molecular mechanism study in vivo for refractory resistant Staphylococcus aureus prosthetictic joint infection and an important tool of preventive and therapeutic measures testing. Models in vivo without clinical epidemic strains, lack of real-time quantitative testing for infection in vivo and difficult detection of viable cells embedded into biofilm on the surface of biomaterial are main faults of current prosthetic joint infection animal models. The clinical epidemic strain was pre-screened with molecular epidemiological study and will be transformed into a labeled MRSA with codon-optimal eGFP fluorescence or codon-optimal Lux bioluminescence through DNA homologous recombination. PJI animal models of MRSA recombinant with long term stability of fluorescence or bioluminescence will be established. The new models will be used to investigate the pathogenesis involved srtA gene of epidemic strain MRSA on PJI and to test in vivo antimicrobial effectiveness of silver nanoparticles plasma immersion titanium alloy as joint implant against MRSA. The project not only provides the basic platform for in vivo molecular mechanisms studies of epidemic MRSA PJI, but also solves current key technical issue of in vivo studies for antimicrobial properties of orthopedic biomaterials.

构建一种基于MRSA临床流行株的假体关节感染模型是研究难治性耐药金黄色葡萄球菌假体感染分子机制和检测各种预防和治疗措施的重要工具。本项目针对目前假体感染体内模型中缺乏临床流行株工具耐药金葡、无法在体实时定量检测感染以及体内材料表面生物膜内活菌检测困难等缺陷，在前期分子流行病学筛选基础上，利用同源重组技术改造细菌，构建含有密码子优化Lux基因生物发光标记MRSA流行株及密码子优化eGFP荧光标记的MRSA流行株。建立具有长效荧光和生物发光稳定性的耐药金葡假体感染体内研究模型，并运用新建模型研究流行株srtA基因敲除对MRSA体内致病机制的影响和注银纳米颗粒钛合金作为关节假体内植物对MRSA感染预防的体内有效性。本研究不仅提供了流行株MRSA假体感染体内分子机制研究的基本平台，同时也解决了目前骨科生物材料体内抗菌性能研究的关键技术问题。

假体关节感染（PJI）的诊治非常困难，特别是当这种感染变为慢性过程，细菌会形成生物膜，抵抗免疫细胞和抗生素的渗透力。虽然国内外对调控机制进行了大量的体外研究，但这些体外结果的显著性差异尚无法提供解决临床问题真正需要的体内致病机制和各种干预措施体内有效性。. 课题组首先通过对来源于临床PJI 分离的金葡菌株进行噬菌体筛选，获得phage11 噬菌体敏感菌株，经MLST 分型为ST1792。使用噬菌体转导和同源重组成功构建出稳定的生物发光细菌ST1792-lux。使用ST1792-lux建立体内新型皮下植入物感染模型及小鼠PJI模型。其次，通过全基因组测序及RNA-SEQ明确工具菌ST1792的遗传背景和PJI环境适应性。随后，采用氧化纳米管银涂层材料构建完成植入材料-细菌-免疫细胞或全血三相体系，并采用复合涂层研究接触抗菌和释放抗菌的组合式效应。然后，采用生物发光金葡菌构建的各种体内外感染模型研究MgF2抗菌机制，并进一步应用于ZnO等骨科植入材料的免疫抗菌研究。最后，尝试性建立双荧光标记体外三相共培养研究体系。. 在基金的资助下课题组建立起完整金葡PJI科学研究平台，包括葡萄球菌基因操作平台、实时定量的生物发光PJI 动物模型、材料-细胞-细菌的三相共培养研究体系，钛基氧化纳米管涂层药物装载平台以及金葡工具菌全基因序列与转录组表达数据库等。通过这些研究平台的建立和运用，提出对金葡PJI 预防的接触抗菌和释放抗菌的组合新概念，阐明氟化镁和氧化锌纳米颗粒钛基涂层在体内的免疫抗菌机制，为这些生物材料的体内抗菌特性提供佐证。. 项目完成为PJI机制研究和新型抗菌植入物临床前研究提供整套新型平台，并筛选出系列具有临床转化前景的抗菌涂层。该项目的成果有望形成一套PJI抗菌药物材料临床前筛选的标准化评价体系，为今后PJI创新诊治手段的评估提供重要保障。