吡啶类有机磷农药对雄性配子DNA甲基化的影响

Male infertility has been a import problem to be resolved. The effects of endocrine disrupting chemicals on male sperm has been the problem caused by endocrine disrupting chemicals in male sperm arises. DNA methylation are found to have a close relationship with male infertility. As the extensive use of pyridine organophosphorus pesticides (OPs), from our earlier research in male rat reproductive toxicity of chlorpyrifos, We found that chlorpyrifos can lead to Gtl2 methylation in sperm of rat, which suggest that role in the regulation of male reproductive toxicity of chlorpyrifos. In order to determine the effect of chronic male reproductive toxicity of chlorpyrifos on DNA methylation, we plans to measure the changes from DNA methylation spectrum、DNA methylation level and the activity of methyltransferase in sperm by exposed rats to chlorpyrifos in different periods and doses. Then we will search the related biomarkers of male reproductive toxicity of pyridine OPs for the sake of safety evaluation of pyridine OPs. This study will contribute the understanding in the epigenetic mechanism of chronic male reproductive toxicity of pyridine OPs and the preventing the effects of pyridine OPs on development of male gametes.

男性不育是亟待解决的重大科学问题。环境内分泌干扰物对人类精子的影响引起了广泛的关注，研究者发现DNA甲基化与雄性不育有着密切的关系。随着吡啶类有机磷农药（OPs）使用量日渐增加，我们在研究毒死蜱对雄性大鼠产生生殖系统毒性的基础上发现其能够引起大鼠精子样本中Gtl2基因甲基化。因此，推测雄性配子的DNA甲基化状态在吡啶类OPs的诱导下会改变，且存在与雄性配子发育毒性密切相关的关键甲基化基因。本课题拟以吡啶类OPs毒死蜱进行染毒，重点观察从交配后第一天染毒毒死蜱的雄鼠配子在不同时间和不同剂量组的DNA甲基化谱的改变，分析雄鼠配子的DNA甲基化水平及DNA甲基化转移酶活性和表达水平的变化，筛选吡啶类OPs对雄性配子产生发育毒性的关键甲基化基因；探讨DNA甲基化在毒死蜱诱导雄性配子发育毒性及安全性评价中的作用，为最终预防和控制吡啶类OPs对雄性配子产生的发育毒性提供理论依据。

【研究背景】.在前面的研究中，我们发现毒死蜱（CPF）的慢性暴露会导致雄性大鼠的生殖系统损伤。然而，CPF的雄性生殖机制尚不清楚，我们试图通过CPF对DNA甲基化影响，从表观遗传的角度探讨其雄性生殖毒性机制。.【研究内容】.将60只21d龄健康清洁级Wistar雄性大鼠随机分为4组，染毒剂量分别为2.7、5.4、12.8 mg/kg，对照组给予蒸馏水吐温80溶液，1次/d，每周6d，连续灌胃90d。染毒结束后，测定生殖相关激素；计算脏器系数；进行睾丸组织学检查；测定睾丸标志酶活性、生殖相关基因表达水平；检测精子数量、精子活动率、观察精子形态；检测 DNA甲基化表达谱的变化。.【研究结果】.1. 毒死蜱对雄性大鼠生殖系统指标的影响.中、高组大鼠附睾尾精子数量和精子活动率均低于对照组，精子畸形率高于对照组（p <0.05）。高、中剂量组睾丸组织病理学检查可见明显异常；与对照组相比，高、中剂量组血清睾酮（T）水平降低，促卵泡刺激素（FSH)水平升高（p<0.05）；高、中剂量组乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸脱氢酶同工酶（LDH-x）活性明显高于对照组（p <0.05）。.2. 毒死蜱对雄性大鼠配子DNA甲基化影响的MeDIP表达谱的影响.DiffReps软件进行差异甲基化区（differentially methylated regions，DMRs）鉴定的结果显示，在毒死蜱暴露组共有27019个差异甲基化区（14150个上调， 12869个下调）。GO分析结果显示，与生物过程相关的上调和下调的差异甲基化区相关基因分布在123和120个注释条目中；与细胞组成相关的分布在20和9个条目中；与分子功能相关的分布在31和19个条目中。本次实验筛选出113条富集上下调甲基化区域相关基因的显著性信号通路。通过生物软件预测分析出高甲基化基因PIK3CD可能在＂Ras signaling pathway＂＂AGE-RAGE＂，＂HIF-1＂， ＂VEGF ＂，＂Glioma and Fc epsilon RI ＂多信号通路的表观遗传调控机制中发挥了重要作用。同时，进一步采用Q-RT-PCR技术验证了这些通路中部分差异表达DNA甲基化区域相关基因和甲基化转移酶mRNA的表达水平。.【科学意义】.该研究初步探讨了配子DNA甲基化在毒死蜱慢性雄性生殖毒性安全性评价和表观遗传学机制中的作用。