K-RAS基因突变对ABC转运体介导的肿瘤多药耐药的影响及分子机制研究

K-RAS基因突变广泛存在于恶性肿瘤中，参与肿瘤细胞的增殖、生长和转移，已成为EGFR抑制剂抗肿瘤活性的负性分子标志物。临床研究也发现存在K-RAS基因突变的肿瘤患者也对多种传统化疗药物不敏感，但机制尚不清楚。本项目组前期工作中在K-RAS不同基因型的肿瘤细胞上比较研究发现K-RAS突变的肿瘤细胞中药物外排ABC转运体的表达和功能可能上调。本项目拟进行深入研究和机制探讨：（1）建立K-RAS突变稳定转染的HEK-293T细胞，比较转染前后细胞中重要ABC转运体P-gp、MRP2、BCRP的表达和功能，及ABC底物类化疗药物的抗肿瘤药效；（2）通过加入信号通路抑制剂的方法初步阐明K-RAS突变对ABC转运体的调控机理；（3）探讨联用K-RAS抑制剂增敏ABC底物类化疗药抗肿瘤作用的新方法。本项目将创新性的阐述K-RAS突变导致化疗药物耐药的新机制，为肿瘤个体化治疗提供新的理论依据和实验基础。

本项目旨在研究肿瘤癌基因K-Ras对ABC转运体介导的肿瘤多药耐药的影响及机理，从而为化疗药物的临床个体化应用提供参考。项目系统研究K-Ras激活型突变对多种细胞毒类化疗药物药效的影响，首次从体外细胞水平证实了K-Ras激活型突变对ABC转运体调控的新机理。主要的研究结论包括：.（1）激活性K-RAS 突变显著降低了胰腺癌化疗药物的药效，且不同突变类型（G12D、G12V、G12R、G13D）的影响亦不同。研究发现G13D突变型细胞对吉西他滨药效降低，而其他突变型与野生型相比没有明显差异。G12D, G13D突变型对SN-38有显著耐药。G12V, G12D与G13D突变型细胞对5-FU有显著耐药。G12V, G12D和G13D都显示对多西他赛具有显著耐药性。K-ras的突变对顺铂的耐药性没有显著影响。.（2）K-RAS突变上调了ABC转运体P-gp、MRP1的表达和功能。BCRP的表达上调但是功能没有显著的影响。细胞摄取的实验结果表明，在K-Ras突变型细胞中，细胞毒类底物药紫杉醇、长春瑞滨的细胞内摄取量都降低。机理研究表明，上述转运体表达和功能的上调可能和K-Ras下游信号通路的p-Akt、p-Erk的上调有关，联用p-Akt抑制剂LY294002、p-ERK抑制剂U0126均能显著下调K-Ras突变细胞上P-gp和MRP1的表达。.（3）联用p-Akt的抑制剂能显著增加化疗药物紫杉醇、米托蒽醌、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨的抗肿瘤作用。深入研究p-Akt抑制剂BKM120与紫杉醇联用的体内外药效和机理。结果表明，BKM120增敏紫杉醇的机理是通过抑制p-Akt通路下调ABC转运体的表达而增加其抗肿瘤作用，荷瘤鼠的体内研究也表明联用BKM120能增加紫杉醇在瘤内的浓度，从而增加其体内抗肿瘤作用。.（4）本项目进一步探索了联用K-Ras下游通路抑制剂和厄罗替尼的药效学及机制。本部分内容是在完成标书研究计划基础上的进一步拓展研究，探索临床胰腺癌治疗的新方案。结果表明p-Akt抑制剂阿米洛利和厄罗替尼联用在多种胰腺癌细胞上具有协同增敏的疗效。. 综合上述研究结论，从肿瘤多药耐药的角度解释了K-Ras突变对多种化疗药物耐药的机理，为从K-Ras信号通路角度逆转肿瘤多药耐药提供了临床前的实验基础，也为胰腺癌的临床治疗提供新的联合用药的方案。