类风湿关节炎湿热瘀阻证敏感蛋白标志物筛选及在证候诊断中的应用初探

Rheumatoid arthritis (RA) is one of the main disabling diseases in nowadays, which is an autoimmune disease with complex networks mechanism involving multiple signaling pathways and existing cross path. We consider that the "heat-dampness and blood stasis" syndrome is the main syndrome and major pathogenesis for active RA, which on the base of the theory of traditional Chinese medicine and a large quantity of clinical practice, and also examined by mechanism experiments. But the material basis of this syndrome is remained unclear, lack of high specific objective basis to ensure the syndrome differentiation consistency accurately in clinical practice. Proteomic techniques study cells or the body by all the protein expression and function, thus has the potential efficient for decoding syndrome biological basis. Proteomic techniques are the most effective way to reveal the essence of TCM syndrome. We will use proteomic technology to explore the protein markers and to applicate those protein markers in syndrome diagnosis of hot-dampness and blood statis syndrome in patients with RA. With strong clinical applicability, this will reveal the scientific connotation of this syndrome, preliminarily guide the syndrome differentiation. Up to now, there is no similar report.

类风湿关节炎(RA)是当今世界主要致残性疾病之一，是多基因、多靶点的自身免疫性疾病，过程中涉及多条信号通路，并存在通路的交叉，形成复杂的机制网络。我科室认为湿热瘀阻证是RA活动期主要证候，易致骨侵蚀，运用清热活血法有多年成果积累，尚需开展RA湿热瘀阻证候研究。蛋白质组学能够动态、整体和定量地考察疾病发生发展过程中蛋白质种类和数量的改变，可以在同一时间观察不同路径中多种蛋白分子的变化，揭示证候发生、发展及转归的分子机制。蛋白质组学技术的出现为寻找证候的微观物质机制提供了可能。本课题拟采用病证结合的方法，利用蛋白芯片技术、质谱技术和生物信息学技术，除选取血清作为样本外，还从湿热瘀阻证辩证要素——舌象的角度，选用唾液为样本，筛选RA湿热瘀阻证敏感生物标志物，以揭示RA湿热瘀阻证微观物质基础，并尝试将其应用于指导临床辩证中，对证候的规范化和确保临床疗效具有十分重要的意义。目前尚无同类报道。

类风湿关节炎在祖国医学中属于“痹病”、“白虎历节”、“尪痹”的范畴，湿热瘀阻证是RA尤其是活动期RA的重要证型，清热活血法是治疗RA湿热瘀阻证的主要方法。证候的规范化、客观化研究一直是中医学与现代医学结合研究的重要方面，以蛋白质组学为代表的系统生物学技术的出现使现代医学由还原论思维走向了整体思维，也使得中医的理念有了数理化的可能。目前尚无课题组以蛋白质组学的技术手段对RA湿热瘀阻证进行探讨。本课题采用病证结合的方法，探讨湿热瘀阻证的微观物质基础。应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱筛选RA湿热瘀阻证差异蛋白，共得出RA湿热瘀阻证差异蛋白72个，其中上调蛋白25个，下调蛋白47个，RA非湿热瘀阻证中得出上调差异蛋白1个，下调蛋白11个，湿热瘀阻证蛋白表达与非湿热瘀阻证蛋白表达存在明显差异。在湿热瘀阻证差异蛋白表达中17个蛋白有文献支持与RA存在直接相关性。以western bolt检测LRG1蛋白验证蛋白质组学结果，经检测湿热瘀阻证组与非湿热瘀阻证相比P＜0.05、与健康对照组相比P＜0.05，非湿热瘀阻证与健康对照组相比P＞0.05，与蛋白质组学一致。采用磁珠分离多肽技术结合基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱，建立RA血清多肽分类模型及RA湿热瘀阻证血清多肽分类模型。血清多肽分类模型通过GA-5算法所建立分类模型为最优分类模型，由五个多肽组成，其m/z分别为2601.05、4967.6、6639.43、1866.29、8144.63。该模型识别率为94.74%，交叉验证率为81.96%，盲法验证准确率为97.5%。RA湿热瘀阻证血清多肽分类模型由GA-7算法所建立分类模型为最优分类模型，由五个多肽组成，其m/z分别为5740.43、4251.35、2863.03、1607.22、4531.5，该模型识别率为97.50%，交叉验证率为80.05%，盲法验证准确率为90%。通过差异蛋白的筛选及分类模型的建立，使我们有了更多的研究方向去探索RA及湿热瘀阻证的发病机制，在治疗上进一步研究中医方药干预对于疾病中蛋白表达的影响，无论对于研究疾病的发病机制还是对于辨证用药的精确化都具有重要意义。