病毒基因沉默抑制子干扰寄主表观遗传调控的新机制

包含siRNAs介导DNA甲基化RdDM的转录基因沉默TGS是植物表观遗传修饰最主要的调控途径。植物依赖TGS产生siRNAs维持大量抗性相关基因的DNA甲基化沉默，动态调控激素介导的基础抗性，以瞬时启动胁迫应答反应，借此降低持续防御激活成本。植物RNA病毒编码的沉默抑制子VSRs，除了在细胞质中抑制转录后基因沉默PTGS，有些VSRs还能进入寄主细胞核干扰RdDM。本项目拟以植物表观遗传调控为主线，以黄瓜花叶病毒CMV的抑制子2b为研究载体，2b和TGS关键效应蛋白AGOs互作为突破口，深入探讨2b干扰植物基因组RdDM的靶标和作用模式；并探究2b如何干扰寄主抗性基因的甲基化调控，以及寄主如何利用抗性基因的siRNAs感应2b的干扰，激活瞬时、全面的防御应答；阐明2b干扰RdDM沉默的VSR活性对CMV自身致病性的生物学作用。力求在CMV-寄主互作的表观遗传调控研究上获得新的认识和突破。

我们围绕本项目的研究目标以植物表观遗传调控为主线，研究黄瓜花叶病毒CMV 的抑制子（VSR）的2b蛋白和TGS关键效应蛋白AGOs互作，深入探讨了2b干扰植物RdDM 的靶标和作用模式和生物学意义。研究发现2b主要定位于细胞核仁中，并首次鉴定了2b的核仁定位信号（NoLS）、结合dsRNA和AGO的结合域；深入研究发现，2b-AGOs的体内互作改变2b的细胞核定位；但2b通过结合dsRNA，而不是结合AGOs，来实现其抑制RNA沉默和DNA甲基化的抑制子活性。.我们同时构建了具有生物学活性的SD-CMV三组份基因组RNA侵染性克隆(CMVwt)，解决了多年来只能从感病植株获取病毒毒源（包含卫星RNA和其他杂质）进行SD-CMV研究的困境。在此基础上，我们进行2b蛋白缺失的突变体改造，并获得了缺失沉默抑制子蛋白2b的突变体病毒（CMVD2b）的侵染性克隆。侵染性克隆（CMVwt和CMVD2b）的获得，为研究由CMV自身表达还是由转基因表达的2b功能差异提供了不可或缺的技术平台。利用该平台，结合对病毒siRNA和病毒致病性的研究，发现一个卫星RNA的小RNA靶向CMV RNAs，引发了依赖RNA-dependent RNA Polymerase 6的抗病毒沉默作用；而2b蛋白对这种抗性具有抑制作用；进而，通过巧妙的结合突变和野生型病毒的竞争性实验进一步证实了，在CMV自然侵染的条件下，2b具有抑制小RNA介导的降解病毒RNA的沉默作用。这是国际上首次用实验直接证明并阐释了自然侵染状态下病毒抑制子抑制寄主抗病表观遗传对病毒致病性的生物学意义。.利用CMVwt侵染和2b转基因植物进行全基因组甲基化检测，分析表明不同形式表达的2b都可以通过最终干扰小RNA介导内源基因的表观遗传调控，但其靶标基因（如水杨酸途径和生长素信号途径）的表达有较大的差异，提示在自然侵染背景下，病毒诱导寄主抗性和病毒抑制子抵抗寄主抗性的相关依赖性和复杂性。进而对2b诱导高表达的一个内源新的非保守miRNA（miR847）进行功能和机制研究，提高miR847降低靶标基因（生长素抑制因子）的表达从而促进植物的生长。结果提示生长素途径调控植物生长可能同时影响植物的抗病性。该项目的研究结果揭示了植物表观遗传途径除了参与生长调控和维持基因组完整性还参与抗生物胁迫应答反应。