有机磷杀虫剂对中华稻蝗超氧化物歧化酶基因的转录调控研究

Oxidative stress is one of the toxicity of organophosphate insecticides. SOD plays important roles in defense against oxidative stress. This project will study the effects of organophosphate insecticides on transcription factors and illustrate the mechanism of transcriptional regulation of SOD in Oxya chinensis. First, important SOD genes will be selected using RNA interference technique based on the sequence of full-length of SOD genes (RACE Amplification Kit). Second, promoter sequences of the selected SOD genes will be cloned using genome-walking technique and the characteristics will be analyzed using relative softwares. Then, the roles of promoter elements of SOD genes will be determined by generating a series of 5' deletions, constructing luciferase reporter plasmids, transfecting insect cells, treating cells using malathion and chlorpyrifos, and measuring the luciferase activities. Meanwhile, the mobility shift assay will be carried out with the complexes of double-stranded oligonucleotied probes end-labeled with [γ-32P]ATP and nuclear extracts from cells. By these means, we will illustrate the mechanism of transcriptional regulation of SOD gene by organophosphate insecticides. This work will provide a reasonable basis for the effective management of Oxya chinensis.

有机磷杀虫剂的毒性之一是对生物体产生氧化胁迫，SOD在抵御氧化胁迫中发挥着重要作用。本项目以中华稻蝗为对象，研究有机磷杀虫剂对转录因子的影响，进而阐明其对SOD基因的转录调控机理。主要研究内容有：1）在RACE法获得SOD基因全长序列的基础上，进行RNA干扰研究，结合马拉硫磷和毒死蜱染毒，测定阴离子自由基含量，筛选出起重要作用的SOD基因。2）通过Genome-walking方法克隆其启动子区序列，并分析其特性。3）通过SOD基因启动子元件缺失、构建启动子－报告基因瞬时表达载体、转染昆虫细胞，用马拉硫磷和毒死蜱处理昆虫细胞，测定荧光素酶活性，确定各个启动子元件在SOD基因转录调控中的作用；将核蛋白抽提液与标记的转录因子结合区多聚核苷酸序列进行孵育，通过凝胶电泳迁移率方法，确定转录因子与SOD基因启动子区的结合特性，阐明有机磷杀虫剂对SOD基因的转录调控机理，为中华稻蝗的有效治理提供依据。

中华稻蝗是一种重要的农业害虫，主要取食禾本科植物，给农业生产造成了严重为害。有机磷杀虫剂是防治中华稻蝗的主要杀虫剂,其毒性之一是对生物体产生氧化胁迫，SOD在抵御氧化胁迫中发挥着重要作用。. 通过RACE-PCR技术，克隆到8条SOD基因全长序列。系统发育分析表明，5条属于CuZnSOD、1条属于MnSOD、2条属于ECSOD。采用原核表达的方式获得6种重组的SOD蛋白，对这6种蛋白的特性进行了分析。6个SOD蛋白的最适反应温度在40-50 ℃左右。CuZnSOD1和MnSOD最耐高温，在85 ℃时仍有活性，CuZnSOD1a、CuZnSOD1c和CuZnSOD2在75 ℃时没有活性，CuZnSOD1b最不耐高温，在65 ℃时即没有活性。CuZnSOD1、CuZnSOD1a、MnSOD和CuZnSOD2的最适pH在8左右，CuZnSOD1b和CuZnSOD1c的最适pH在7左右。CuZnSOD1及其剪切蛋白不太耐酸性环境，在pH值3以下，没有活性，MnSOD和CuZnSOD2最不耐酸性，在pH值4以下，没有活性。6个重组蛋白均较耐碱性，在pH值12均有活性。. 采用RT-qPCR的方法研究了马拉硫磷对中华稻蝗SOD基因表达的影响，结果表明，马拉硫磷未对CuZnSOD1和CuZnSOD2基因的表达产生影响。马拉硫磷诱导了中华稻蝗MnSOD基因的表达，ECSOD1的表达呈现低浓度抑制高浓度诱导的现象，ECSOD2的表达被低浓度马拉硫磷诱导。.采用RNAi的方式，研究了5个SOD基因在氧化胁迫中的作用。在马拉硫磷处理后，注射ECSOD1和MnSOD双链的中华稻蝗，其体内的ROS含量显著高于对照组，由此可以看出，这两个基因在马拉硫磷对中华稻蝗的氧化胁迫中起重要作用，特别是MnSOD。. 构建了含荧光素酶报告基因和启动子顺次缺失片段的重组载体，与内参载体pRL-TK共转染S2细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果表明，马拉硫磷能上调MnSOD基因启动子的活性。存在于-1007—-653区的C/EBPalp的转录因子结合位点和-393—+54区的AP-1结合位点可能在马拉硫磷对中华稻蝗MnSOD基因的转录上调表达中起重要调控作用，在-1185—-1007区Sp-1可能降低Mn-SOD基因的表达或者是在该区可能有沉默子存在。