大黄鱼乙酰辅酶A羧化酶的基因克隆、定位和功能研究

Fatty liver syndrome commonly occurs in large yellow croaker (Pseudosciaena crocer R.) farmed in seacage, and has become a problem troubling the farmers. Excessive fatty acid accumulates in the liver and causes disorder of fatty acid anabolism, which may be the primary cause for fatty liver of large yellow croaker. Acety1-coenzyme A carboxylase (ACC), a rate-limiting enzyme during the whole process of fatty acid anabolism, is closely related with formation of fatty liver. Reports on fish ACC related with formation of fatty liver have yet to be seen both at home and abroad. This project took the most important farmed fish in Fujian Province - large yellow croaker, as the research material, and integrated the technologies of molecular biology, cell biology and immunology to carry out basic research on fatty liver syndrome, a key problem in fish farming. The purpose is to firstly clone the full-length cDNA sequence of the ACCs from the large yellow croaker, to investigate the expression profile and localization of ACCs. Based on this, the role of ACCs cloned in formation of fatty liver would be analyzed using antisense nucleic acid, and the molecular mechanisms of fatty liver would be revealed. This would not only fill the research gap on fatty liver, especially fatty liver of fish, broaden the knowledge of the molecular mechanism of the fatty liver syndrome, but also provide a theoretical basis to find a effective solution for the fatty liver of large yellow croaker.

脂肪肝病变在人工养殖大黄鱼中非常普遍，已成为养殖者的难题之一。过量脂肪酸沉积在肝脏中，导致脂肪酸合成代谢发生紊乱，可能是造成大黄鱼脂肪肝的主要原因。乙酰辅酶A羧化酶(Acety1 CoA Carboxylase,ACC)是整个脂肪酸代谢合成过程的限速酶，与脂肪肝的形成密切相关。目前国内外尚未见鱼类ACC与脂肪肝病变关系研究的报道。本项目以福建省最重要的养殖鱼种- - 大黄鱼为研究材料，针对养殖中存在的关键问题即脂肪肝病变的问题，整合分子生物学和细胞生物学及免疫学相关技术开展基础研究；旨在首次克隆大黄鱼ACC基因全长cDNA序列，明确ACC的定位，解析ACC的表达模式，在此基础上利用反义核酸技术鉴定ACC在脂肪肝形成中的作用，揭示脂肪肝病变的分子机制。这不仅填补了国内外有关脂肪肝尤其是鱼类脂肪肝的研究空白，拓宽了脂肪肝病变分子机理的知识内涵，而且为寻找解决大黄鱼脂肪肝的有效途径提供理论基础。

乙酰辅酶A羧化酶(Acety1 CoA Carboxylase, ACC)是整个脂肪酸代谢合成过程的限速酶，与脂肪肝的形成密切相关。目前国内外尚未见有关大黄鱼ACC 研究的报道。本项目以福建省最重要的养殖鱼种——大黄鱼为研究材料，针对养殖中存在的关键问题即脂肪肝病变的问题，整合分子生物学和细胞生物学及免疫学相关技术开展基础研究。本项目采用RT-PCR技术，克隆得到大黄鱼乙酰辅酶A羧化酶（PcACC）基因的cDNA片段序列，序列分析表明：该片段序列共有6576 bp，编码了由2192个氨基酸残基组成的肽段。编码的氨基酸序列与不同生物的ACC进行同源性比较，结果表明，PcACC与其他物种的同源性较高都达到87%以上。其中，与草鱼的同源性最高达到97%。构建PcACC基因编码区近3’端长度为795 bp区段的原核表达载体pPET32a-PcACC，将其转化到大肠杆菌表达菌种E. coli BL21( DE3) 中进行优化表达。融合蛋白经纯化后进行Western blot验证，结果表明，IPTG 可诱导一个分子量约35 kD的特异蛋白，且主要以包涵体的形式存在。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析结果显示，PcACC基因在大黄鱼被分析的8 种组织中均有不同程度的转录表达，其中在肌肉组织中表达量最高，肝组织次之。同时，扩增了大黄鱼β- actin（PcActb）基因的开放阅读框（Open reading frame, ORF）序列。qRT-PCR分析结果表明，PcActb基因在大黄鱼各组织中的表达稳定。构建PcActb基因ORF的原核表达载体pPET32a-PcActb，表达的融合蛋白纯化后经Western blot验证，结果表明，获得一个分子量约45 kD的特异蛋白。本项目首次克隆了PcACC基因的cDNA片段序列，分析PcACC基因转录水平的表达模式，并得到特异性原核表达融合蛋白，为下一步制备抗体并对PcACC进行定位、利用反义核酸技术鉴定ACC 在脂肪肝形成中的作用，揭示脂肪肝病变的分子机制奠定基础。PcActb基因的qRT-PCR分析结果表明了它在转录水平作为分子内参的可靠性；特异性pPET32a-PcActb的获得为进一步制备抗体，鉴定PcActb基因表达量在转录后水平是否具显著差异，从而评估其能否作为大黄鱼功能基因转录后水平表达量差异分析时的内参标准。