rap2b基因在支气管上皮细胞恶性转化及肺癌发生发展中的作用

rap2b是从抑制性消减杂交方法构建的人肺鳞癌高表达cDNA文库中筛选出的一个肺癌相关候选基因，课题组前期研究提示其在肺癌组织中高表达且病人多有吸烟史，体外试验表明，rap2b高表达可导致NIH3T3细胞恶性转化。本研究拟选用烟草烟雾中的主要致癌成分苯并[α]芘（BaP）诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化，探讨不同的转化阶段，BEAS-2B细胞rap2b的表达及相关信号通路中关键基因产物NF-κB 、MAPK等的变化；用RNAi技术抑制转化细胞的rap2b表达，观察rap2b表达抑制能否诱导转化细胞的凋亡或表型逆转；用BaP染毒SD大鼠，观察染毒不同阶段Rap2B蛋白以及NF-κB、MAPK等信号分子的表达改变及其与肺组织病理学改变的关系，在整体动物水平探讨rap2b在肺癌发生发展中的作用及其机制。实验结果将为寻找特异的肺癌早期诊断生物标志和更有效的干预与治疗靶点提供实验依据。

目的：探讨rap2b在BaP所致人支气管上皮细胞恶性转化过程中的作用及可能的机制。方法：支气管上皮细胞暴露于染毒物 24h，CCK-8法确定染毒剂量，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，通过染色体畸变分析、软琼脂克隆形成实验及裸鼠成瘤实验鉴定细胞的恶性转化程度；采用RT-PCR、Western blot技术检测Rap2B基因和蛋白的表达情况；以联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法 的方法检测全基因组甲基化情况的变化；亚硫酸氢盐测序的方法检测Rap2B基因启动子区甲基化情况的变化；采用RNAi技术沉默Rap2B基因。结果：CSE暴露BEAS-2B细胞后可导致IL-8 mRNA表达增加（P＜0.001）；CSC对16HBE细胞有毒性作用，通过软件计算CSC染毒16HBE细胞24 h的半数抑制浓度IC50为0.08±0.006 mg/ml；16HBE细胞暴露CSC 24 h后，细胞形态发生一定改变，高剂量组细胞变为不规则形状；随着染毒次数的增加，16HBE细胞染色体畸变率逐渐增加，P20与P30代细胞染色体畸变率分别为12%与18%，与对照组比较与统计学意义（P<0.05）；软琼脂克隆形成实验发现P30代细胞的克隆数与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；裸鼠肿瘤形成实验发现注射P30代细胞14 d后可以发现肉眼可见肿瘤，至注射后28 d的形成明显肿瘤组织；慢性过程中P30代细胞Rap2B基因mRNA表达水平与蛋白表达水平稳步增加，与DMSO组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；慢性转化过程中各代细胞全基因组总体甲基化变化情况LINE-1片段与DMSO组比较差异有统计学意义（P<0.05），LINE-1甲基化率呈下降趋势；Rap2B基因启动子区表现出低甲基化；B(a)P染毒BEAS-2B细胞后Rap2B基因mRNA和蛋白表达量均高于空白对照组和DMSO组，差异有统计学意义（均P ＜0.05）；Rap2B基因干扰后细胞的增殖和迁移能力受抑制，干扰组与非干扰组、空白对照组相比：细胞凋亡率、G1期细胞百分比升高，S期细胞百分比、G2/M期细胞百分比降低， p38、p65基因mRNA和蛋白表达量降低，差异均有统计学意义（均P﹤0.05）。结论：Rap2B可能通过对NF-κB和MAPK通路的活化作用在烟草致癌过程中发挥重要作用。