滇产山小橘属植物中铜绿假单胞菌III型分泌抑制剂的研究

鉴于前期研究发现滇产山小橘属药用植物具有显著的抗临床耐药铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）III型分泌[Type III Secretion （T3S）]毒素ExoU的活性，本项目拟采用活性导向分离法，进一步研究光叶山小橘 [Glycosmis lanceolata (B1.) Sprehgel ex Teysm.et Binn.] 等四种同属植物中抗PA T3S的活性成分，包括研究直接抗T3S的活性成分和对活性成分与现有抗菌素联合应用的评价，考察这些成分单独或与抗生素合用阻断PA毒素分泌的作用或减少抗生素用量的潜力。在此基础上进一步探讨其抗T3S的作用方式，寻找抗PA作用机制新颖的先导化合物，从源头上为创制具有自主知识产权抗PA新药奠定基础。

两种临床常见的感染性病原菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和天然及获得性耐药的铜绿假单胞菌（PA）使现有抗菌药物抗感染治疗受到了严峻挑战，亟需开发新的药源，研发新型抗耐药菌药物。当前，从中草药等天然资源研发潜在的抗耐药菌新药和抗感染新型途径已成为国内外学者关注的一个重要领域。但与MRSA相比，PA细胞对中草药成分透过性差，难于发现理想的抗PA活性成分；相反，针对PA III型分泌系统毒力因子ExoU 磷脂酶A2（PLA2）抑制剂的抗PA策略是一个值得探索的方向。采用活性导向的植物化学方法对400余种滇产中草药提取物抑制PA的PLA2和抗MRSA成分进行了系统筛选和跟踪研究，用棋盘式微量稀释法和动态时间-杀菌曲线法评价了抗PA和MRSA药效成分与临床常用抗菌药物联合的抗耐药菌协同增效作用。获得的重要成果包括①中草药抗PA成分及对毒力因子sPLA2的抑制作用：发现穗花杉双黄酮和表木栓醇具有较强抗PA活性和抑制sPLA2作用，其MIC50 (n=12) 分别为128和150 mg/L。二者抑制sPLA2的IC50 (mol/L) 分别为380和617；二者与头孢头孢他啶联用具有协同和相加作用, 其部分抑菌浓度指数FICI为0.18~1.25。提示PLA2抑制活性可能是其抗PA作用的机制之一；PLA2抑制活性也可能是该二个化合物阻断PA ExoU毒力因子的独立机制。二者兼具直接抗PA作用及消除PA毒力因子的作用，值得进一步研究。②直接抗MRSA成分：发现厚朴中厚朴酚与和厚朴酚单用MIC/MBC值（16 ~ 64 mg/L）与阿米卡星（Ak）和庆大霉素（Gm）相仿，二者与氨基糖苷类等多种常用抗菌剂呈广谱协同抑菌（FICIs在0.25 ~ 0.5）和杀菌（△LC24范围在2.02 ~ 2.25）作用；苏木中原苏木素A和B单用的MIC50值分别为64 和128 mg/L，与Ak和Gm等也呈协同 （FICI在0.078~0.500）并逆转耐药作用且细胞毒性很低；发现丹参多酚酸盐MIC为128-256mg/L，可与氨苄青霉素等协同（FICIs值为 0.375-0.5），并逆转MRSA对Ak的耐药性。研究结果进一步阐明了有关中草药抗PA和MRSA的物质基础，丰富了中草药抗耐药菌化学成分，展现了中草药抗PA毒力因子机制的前景，为从病原菌毒力因子途径克服耐药性提供了科学依据。