分子伴侣自噬（CMA）在乳腺癌转移中的作用及机制研究

Breast cancer is a major gynecological malignancy that threatens the health of females, with tumor metastasis being one of the main cause of death and obstacles in raising cure rate. We previously discovered by tissue chip analysis that the key protein lysosomal-associated membrane protein 2A (LAMP2A) in the chaperone-mediated autophagy(CMA) pathway was abnormally over expressed in the epithelial tissue of breast cancer, and the level of LAMP2A expression has a positive correlation with breast cancer grading. Meanwhile, through the tests of transwell invasion and subcutaneus innoculation of BALB/c nude mice with different cell strains of diverse LAMP2A expression levels, we found that CMA could promote the metastasis of breast cancer cells; Gene chip analysis after downregulation of LAMP2A revealed the gene expression level varied in the sphingosine kinase Sphk1/S1Psignaling pathway closely related with tumor metastasis. Based upon previous work, this project aims to further elucidate the role of CMA in the metastasis of breast cancer and to investigate the possible molecular mechanism in which CMA promotes breast cancer metastasis by regulation of the Sphk1/S1P signaling pathway with in vitro and in vivo cell and animal models and clinical samples. This project will benefit improving our knowledge in the field of breast cancer metastasis from a CMA perspective, providing useful clues and possible therapeutic targets for clinical diagnosis and treatment of the disease.

乳腺癌是严重威胁妇女健康的重大疾病,转移是乳腺癌患者的主要死因和影响救治率进一步提高的关键因素，深入阐明其中的具体机制对于提高乳腺癌的防治水平具有重要意义。我们前期通过组织芯片，发现CMA途径的关键蛋白LAMP2A异常高表达于乳腺癌上皮组织，且与乳腺癌的分级呈正相关；通过Transwell侵袭和裸鼠接种试验，发现CMA能促进乳腺癌细胞转移；基因芯片结果显示，LAMP2A表达下调后，与肿瘤转移密切相关的SphK1/S1P信号通路相关基因表达发生改变。由此我们推测CMA可能通过SphK1/S1P信号通路进而促进乳腺癌细胞转移。本项目拟在上述工作基础上，通过小鼠乳腺癌肺转移等体内外转移模型及临床样本，进一步明确CMA在乳腺癌转移中的作用，并探讨CMA调节SphK1/S1P通路促进乳腺癌转移的可能分子机制。旨在为从CMA角度解释乳腺癌转移新机制积累资料，并为临床乳腺癌诊治提供可能靶点和有益线索。

乳腺癌是严重危害妇女健康的重大疾病，其主要死因源于乳腺癌转移，已成为乳腺癌防治中的一大难题。分子伴侣自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）在肺癌、黑色素瘤等肿瘤转移中的研究已受到医学界的广泛关注。本课题首次系统观察了CMA在乳腺癌转移中的作用及其分子机制。主要研究内容：①通过免疫组化检测乳腺癌组织芯片，观察CMA与乳腺癌的分级及分期的关系；通过LAMP2A shRNA和LAMP2A过表达慢病毒表达载体感染，构建CMA活性高低不同的乳腺癌细胞株；在此基础上，通过MTT、Transwell迁移与侵袭、血清诱导的伤口愈合以及裸鼠皮下成瘤和尾静脉乳腺癌细胞肺转移实验，观察了CMA在乳腺癌细胞增殖转移中的作用。②以CMA活性高低不同的乳腺癌细胞株为研究对象，通过荧光定量PCR、Western Blot和siRNA转染、免疫组化等技术，探讨了CMA调节乳腺癌细胞增殖转移的可能分子机制。③采用血管内皮细胞管腔形成实验和免疫组化检测瘤体组织中CD31或CD34的表达等方法和技术，观察了CMA对乳腺癌血管形成的作用。在此基础上，采用荧光定量PCR检测不同促血管生成因子表达、Western Blot检测VEGFA表达、乳酸试剂盒检测乳酸含量、细胞外酸化率实验检测细胞内产酸量等方法和技术，探讨了CMA调节乳腺癌血管形成的分子机制。主要研究结果： ①发现CMA具有促进乳腺癌细胞增殖转移的作用；②证实CMA促进乳腺癌增殖转移与其下调ATG5-依赖的大自噬信号通路有关；③发现CMA具有促进乳腺癌血管形成的作用；④证实CMA促进乳腺癌血管形成与其促进VEGFA表达及其激活糖酵解通路有关。结论：CMA促进乳腺癌细胞增殖转移与其下调ATG5依赖的大自噬水平密切关系；CMA通过上调VEGFA表达及激活糖酵解通路进而促进乳腺癌血管形成。本研究结果有助于完善对乳腺癌CMA与转移机制的认识，为临床乳腺癌的诊治提供新的思路及靶点。