GSK3β激酶调控SKAP蛋白磷酸化在有丝分裂中的功能研究

Mitosis is the most dramatic, as well as critical event in the cell cycle. Errors in this process can lead to aneuploidy or genetic instability, fostering cell death or tumor development. SKAP is a newly defined microtubule plus end protein，our previous work showed that SKAP forms a link between kinetochore core complex KMN and dynamic spindle microtubules, and our studies indicated that SKAP represents an important function in regulating spindle plasticity. However, it still remains elusive as how is the mechanism underlying spatiotemporal regulation of SKAP. Using the combination of a series of newest technology，we aim to answer how GSK3β kinase regulate the function of SKAP during mitosis. And we will using a fluorescence resonance energy transfer-based reporter to exam the temporal dynamics of protein phosphorylation by GSK3βkinase during the whole cell cycle. In addition, we will evaluate whether phosphorylation regulates the expression level of SKAP during cell cycle. Taken together, we hope that the smooth implementation of the project will deepen our understanding of mitosis, and provide the scientific basis for disease etiology and possible clinical intervention approaches.

在整个细胞复制周期的过程中，有丝分裂起承上起下的作用。如果其出现异常，可导致染色体不稳定性并促进肿瘤的发生和发展。SKAP是新近发现的一个定位于微管正末端的重要有丝分裂调控蛋白，我们已有的结果表明SKAP通过介导微管与动点之间的桥联，调控纺锤体的可塑性，但是其具体的分子机制及其可塑性的动态调控机理仍未完全明了。本项目拟通过一系列先进的技术手段，系统地评估GSK3β激酶调控SKAP蛋白磷酸化在有丝分裂期的功能；我们还将利用生物光子学探针的方法阐明GSK3β激酶活性在细胞周期进程中的时空动力学特征及其生理意义。此外，我们还将评估GSK3β磷酸化是否调节SKAP蛋白在细胞周期中的表达水平。相信本项目的顺利实施将会加深我们对细胞有丝分裂过程的认识，为相关疾病的病因学和可能的临床干预途径提供科学依据。

在本项目的支持下，我们按照原定计划出色地完成了各项任务。系统地评估了GSK3β激酶调控SKAP蛋白磷酸化在有丝分裂期的功能。在研究过程中我们鉴定出一个新的与SKAP有相互作用的蛋白Kif2b，初步阐明了其在体内功能发挥的调节机制，证明GSK3β通过对SKAP的磷酸化进而调控了Kif2b的活性。我们发现：SKAP与Kif2b的相互作用在有丝分裂期的中期最强，而GSK3β磷酸化SKAP进一步增强了SKAP与Kif2b的结合能力，从而降低了Kif2b的微管解聚酶活性。揭示了GSK3β-SKAP-Kif2b信号通路在保证有丝分裂纺锤体稳定性和染色体忠实分离过程中的作用。. 除了在有丝分裂期中对SKAP的研究，我们在间期对SKAP的功能也进行了探讨。经过系统的研究分析，我们鉴定出一个新的复合物SKAP-IQGAP1，阐明了该蛋白复合物在细胞周期间期在体内的功能发挥及调节机制。我们发现：SKAP通过它的C端与IQGAP1的WWIQ结构域相互结合，而EGF的刺激会增强两个蛋白之间的结合，促进SKAP在细胞膜褶皱处的富集；我们还发现SKAP参与了在EGF刺激下细胞的迁移过程，利用siRNA或shRNA敲低细胞内SKAP的蛋白水平会抑制细胞的迁移。除此以外，利用siRNA或shRNA敲低蛋白表达水平的方法以及可以透膜的TAT-WWIQ多肽的技术，我们证明了IQGAP1 和SKAP之间的相互作用对SKAP在膜褶皱处的富集以及细胞的定向迁移至关重要。