长爪沙鼠SREBP-2基因的克隆及其对胆固醇合成的调控作用

胆固醇代谢紊乱是高胆固醇血症的主要原因，可导致人类多种重大疾病，研究其发生的分子机制对预防心脑血管疾病和保护人类健康具有重要意义。长爪沙鼠是我国特有的实验动物，有易发高胆固醇血症及血浆脂质成分与人类相似等特点，是研究胆固醇代谢良好的模型动物。目前发现长爪沙鼠高胆固醇血症能被胆固醇合成限速酶抑制剂所抑制，其他有关其胆固醇代谢的机制还未见任何报道。胆固醇合成限速酶主要受SREBP-2调控。推测长爪沙鼠与其他动物SREBP-2的结构和功能存在差异并导致其易发高胆固醇血症。为验证上述推测，本项目拟采用同源克隆和RACE方法克隆SREBP-2基因，并通过生物信息学方法比较长爪沙鼠与其他动物在基因序列、氨基酸序列和蛋白质结构上的差异；利用基因过表达和RNAi技术分析SREBP-2基因表达对长爪沙鼠肝细胞胆固醇合成的调控作用，揭示长爪沙鼠易发高胆固醇血症的分子机理，为人类高胆固醇血症的防治寻求新的靶点。

本研究利用同源克隆和RACE技术成功克隆长爪沙鼠HMG-CoA 还原酶基因及其主要调控因子SREBP-2的cDNA序列，HMG-CoA还原酶基因cDNA序列3622bp，编码序列2664bp；长爪沙鼠SREBP-2基因cDNA序列4307bp，编码1193个氨基酸，预测bHLH的三级结构域和S2P和S1P酶切位点，利用SREBP-2基因的进化分析结果发现，长爪沙鼠与鼠亚科动物具有近的计划关系，本研究进一步克隆了长爪沙鼠线粒体基因组并对基因定位、密码子分布和进化分析，结果显示，长爪沙鼠应为鼠亚科动物，而非仓鼠亚科。成功构建了基因过表达载体（P55-35和P55-39）和shRNA载体（SL23-1~4）并建立了长爪沙鼠肝细胞原代培养培养方法；通过在肝细胞中对SREBP-2基因的过表达和沉默发现，增加SREBP-2基因表达可以有效增加肝细胞胆固醇和甘油三酯和合成；沉默SREBP-2基因的表达对虽然有效降低SREBP-2和HMGCR在mRNA和蛋白质水平，但是肝细胞合成胆固醇影响没有对基因表达影响明显。说明长爪沙鼠SREBP-2对于胆固醇合成反馈调节不敏感。