质粒介导的喹诺酮类耐药性基因在环境污水中传播及相关耐药肠道细菌的遗传结构分析

本研究目的对济南地区废水环境中性细菌中质粒介导喹诺酮耐药性基因(PMQR)的生态分布以及相关耐药肠道细菌的耐药机制进行调查研究，力求对目前我国PMQR基因在水环境中污染的状况有一个大致的了解。通过实时荧光定量PCR技术，对不同生态环境下PMQR基因污染情况的比较，能够评估这些耐药因子在自然环境下的潜在危险性。对环境中PMQR基因耐药肠道细菌耐药机制的研究，把自然环境中的耐药菌与临床上的致病菌或条件致病菌的耐药性联系在一起。分析自然环境中耐药基因易重组、易传播的特性可能对人类健康所产生的影响。通过质粒提取、转化、接合转移、脉冲场电泳和Southern杂交等技术筛选PMQR基因质粒，从而发现新型耐药基因及耐药机制，为开发新型抗菌药物奠定坚实的基础。同时推断自然环境污染物的排放对细菌适应性及进化所形成选择压力的作用，及质粒在细菌进化和适应性中所起的重要作用。

质粒介导喹诺酮耐药 (PMQR) 基因包括qnr 类、qepA及aac(6')-Ib-cr基因虽赋予细菌低水平的喹诺酮耐药性，但却为高水平的突变耐药奠定了基础。我们从济南地区医院、城市污水处理厂废水及河水样本中提取DNA，通过荧光定量PCR的方法主要对PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、aac(6′)-Ib-cr及16SrRNA基因进行定量。qnrA基因污染比较严重的是西医为主的医院废水以及污水处理厂废水；依次是河水、中医院废水。研究还显示qnrA基因的含量与水样中的细菌含量成正相关。此外，我们还检测其它的PMQR基因包括qnrB、qnrC、qnrS和aac(6′)-Ib-cr在3、4、5、6、7、8、9、10月份的拷贝数。虽然环境因素比较复杂，但总体来说，各采样点的PMQR基因的含量基本都在105copies/L以上，处于一个比较高的范围；对于大部分的PMQR基因，在4、5、6、7月，都呈现比较高的态势。值得注意是被生活污水污染的河水中PMQR基因已经处于一个相对较高的数量；比较4种PMQR基因的拷贝数，aac(6')-Ib-cr的含量最高，齐鲁医院和光大水务的水样中该基因拷贝数值都高于109copies/L，依次是qnrC、qnrS、qnrB。水环境中的微生物群落结构及多样性分析显示，五个取样点的物种多样性水平较为稳定，没有显著差异性，光大水务站点的丰富度是最高的。在所有样品中含量都较高是变形菌门和拟杆菌门，较为广泛存在的菌种有不动杆菌，黄杆菌，拟杆菌，假单胞菌，弓形杆菌。分析结果显示Rheinheimera和Cloacibacterium属与qnrA基因的存在有正相关性。从水环境水样中分离的391株耐药菌中，筛选到31株含有qnr基因的菌株和41株含有复杂1型整合子的ISCR1元件的菌株，对qnr基因进行分型共发现了qnrA1、qnrB2，qnrB4，qnrB6，qnrB9，qnrS1六种变体及qnrB26一种新变体，aac(6')-Ib-cr和qepA以及其它耐药基因在qnr基因阳性菌株中也普遍存在。其中某些PMQR基因可随整合子发生水平转移。分析ISCR1元件下游结构共发现8种不同的基因排列，其中3种结构中含有qnr基因，另外有3种结构各含有一种新型的二氢叶酸还原酶基因（dfr）。研究发现这些新型dfr基因可介导一定水平的甲氧苄啶耐药性。