乙烯受体ETR1的GAF结构域亚复合物成分鉴定及其功能研究

The components of a given signal transduction pathway are usually associated into high-molecular-mass protein complexes which have currently caught extensive studies in the field of signaling research. Membrane protein complexes turn difficult to handle due to their trace amounts in the cell and hard to concentrate. The receptors of ethylene have 5 members at the Arabidopsis endoplasmic reticulum (ER). Each of them could be part of high-molecular-mass protein complexes with sizes around 700 kDa.ETR1 is one of ethylene receptors. It contains transmembrane domain, GAF domain and HRR domain. Each domain has associated with different sub-complexes of proteins. Although significant progresses have been made in identification of components of the ethylene signal pathway, little is known about the identity of the protein complexes associated with receptors, especially the sub-complex associated with the GAF domain. We plan to use the GAF domain of ETR1 as the bait, to screen the cDNA library from ethylene treated etiolated seedlings, by using yeast two hybrid technology, and eventually try to identify 1 or 2 new protein factors interacting with the GAF domain. Their functions will be uncovered by using the loss-of-function mutation and overexpression of the encoded genes. These pieces of new evidence genetically and biochemically will contribute to better understand the signaling mechanisms through the Arabidopsis receptors.

乙烯是重要的植物气体激素，参与调控植物的多种生长发育和胁迫响应的调控，研究表明，乙烯受体定位于内质网，其不同的结构域结合有不同的亚复合物，虽然乙烯信号通路中受体下游的重要组分已经有很多被揭示，但受体复合物本身的成分并不够清楚，尤其是和ETR1的GAF结构域相结合的亚复合物还没有成分被鉴定出来。GAF结构域分布广泛，研究发现在微生物中该结构域与活性氧胁迫响应密切相关，但在植物中的研究较少，作用并不明确。本研究基于以上结果，以乙烯受体ETR1的GAF结构域为诱饵，通过酵母双杂交系统筛选拟南芥的cDNA文库，得到候选蛋白后结合其他蛋白质互作技术拟筛选出至少1-2个与GAF结构域发生相互作用的蛋白，并产生相应的转基因植株进一步分析其组分的功能，为进一步解析乙烯信号通路以及GAF结构域在植物中的功能提供有价值的线索。

乙烯受体ethylene receptor 1（ETR1）在拟南芥中在参与调控乙烯信号通路中起着非常重要的作用。但是，ETR1参与调控乙烯信号通路以外通路的研究相对较少。本研究利用对乙烯有正常响应的ETR1的功能缺失突变体etr1-7鉴定ETR1参与调控的且与其它受体冗余的功能。结果显示，在高温条件下（32℃）与野生型Col相比，叶柄伸长受到了抑制。转移至高温条件下后，ETR1的氮端（N端）第二个疏水域发生突变的etr1-1，etr1-7和etr1-9的叶柄均无法正常伸长，而该区域没有突变的etr1-3在高温下的叶柄伸长与野生型相比并没有明显区别，暗示了ETR1中第二个跨膜域在ETR1调控高温下的叶柄伸长有着不可或缺的作用。另一方面，由于etr1-3无法正常响应乙烯信号但高温下的叶柄长度与野生型相比无明显区别，暗示该表型是不依赖与乙烯信号途径的。RNA-Seq分析与GO富集分析表明，ETR1很可能参与调控光合作用与蛋白降解，暗示ETR1很可能参与调控这类信号通路。为进一步揭示ETR1是如何调控高温下的表型，利用ETR1的GAF结构域作为诱饵，利用酵母双杂交系统筛选出28个可能与ETR1发生相互作用的候选蛋白。我们发现酵母筛库得到的候选基因中包含了光系统复合体II的组成成分之一LPA3。进一步的酵母双杂交和双分子荧光互补（BiFC）结果显示，ETR1可以与LPA3发生相互作用，且ETR1的GAF结构域是发生相互作用所必须的。乙烯利在作为矮化剂使用时，常伴有减产的风险，根据以上结果推测，这很可能是由于乙烯抑制了ETR1所从而影响了光合作用所导致的的，为此我们利用小球藻体系筛选出具有增强光合作用的活性分子甜菜碱。外施甜菜碱可以显著增强小球藻的碳固定途径，最终增加其生物量和油脂产量。田间实验进一步表明，将其与乙烯利复配后，在玉米上使用可以显著降低玉米的株高，同时能够改善单独使用乙烯利造成的凸尖增加等造成减产的负面效应，降低了乙烯利的使用风险，我们的结果为鉴定ETR1以及GAF结构域在植物中的功能以及乙烯在生产中的开发利用提供了有价值的线索。