大肠杆菌L-色氨酸合成的调控及分子改造研究

L-色氨酸(L-Tryptophan)是一种重要的芳香性氨基酸，是人体和动物生命活动所必需的8种氨基酸之一，在食品、医药饲料等行业具有广泛 应用。大肠杆菌L-色氨酸的合成途径比较复杂，两种前体物分别是糖酵解途径的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途径的中间产物赤酰糖-4-磷酸（E4P），并且其代谢合成受多种调控因子的多层次调控。本研究首先从大肠杆菌L-色氨酸的合成途径入手，利用基因敲除、定点突变、启动子改造等手段，对反馈抑制、阻遏作用、前体物水平等限制性因素进行分析，研究它们对L-色氨酸合成的影响，从而构建出L-色氨酸的基本发酵菌株。然后利用RT-PCR，转录组学等技术，对基本发酵菌株进行分析，探索大肠杆菌L-色氨酸合成的未知的限制性因素和分泌机制，完善大肠杆菌L-色氨酸的合成与代谢的调节网络，并在此基础上，构建高效积累L-色氨酸的大肠杆菌工程菌。

L-色氨酸作为一种非常重要的芳香性氨基酸，对人和动物的生长发育起重要作用，广泛应用于食品、医药、饲料等方面。本项目利用基因的敲除、定点突变及过量表达等技术，对野生型大肠杆菌W3110进行了代谢工程改造。通过敲除阻遏蛋白TrpR，色氨酸酶TnaA，以及编码葡萄糖依赖的磷酸转移酶系统中酶IIBC组分的ptsG基因，并过量表达了定点突变解除反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶trpE3、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮酸-7磷酸（DAHP）合酶aroG1以及磷酸戊糖途径中编码转酮酶的基因tktA，构建了L-色氨酸基本产生菌株GPT1001。摇瓶发酵显示该菌株的L-色氨酸可以达到1.2 g l-1。在此基础上，一步法完成了色氨酸衰减子的敲除及色氨酸操纵子野生型启动子的替换，成功构建了重组大肠杆菌GPT1002。RT-PCR检测到五个色氨酸操纵子基因的转录均出现上调。摇瓶发酵实验表明，GPT1002的生长未受到影响，并且可以积累1.7 g l-1的L-色氨酸，比对照菌株GPT1001高出41.7%。在5-l发酵罐中，L-色氨酸产量可以达到10.15 g l-1。进一步改造Mtr、TnaB和AroP 三个透过酶，L-色氨酸产量可以达到16.3 g l-1。利用色氨酸和聚β-羟基丁酸（PHB）联产，能够显著提高色氨酸操纵子基因的转录。通过尝试以不同比例的葡萄糖和木糖作为碳源并对两种产物及副产物进行分析，确定了两种碳源的最优组合，为L-色氨酸的工业化生产提供了重要的研究基础。