miR-145调节毛囊干细胞修复膀胱缺损中的作用机制研究

As an ideal seed cell, stem cells are widely used in tissue engineering. Scientists have used stem cells and acellular scaffolds to repair tissue and organ defects. The next step is to discover and identify the critical conditions and factors, and to elucidate the molecular mechanisms involved in tissue engineering. Based on the domestic and foreign research, we have prepared the bladder acellular matrix which has no toxicity and good biocompatibility. The hair follicle stem cells were differentiated into smooth muscle cells in the microenvironment of the bladder after implantation of hair follicle stem cells which were grown on the bladder acellular matrix scaffold. In order to improve the efficiency of induction, we designed this study, to further understand the mechanism in this process, applicate the new research method, clarify the mechanism of miR-145 in hair follicle stem cells to repair bladder smooth muscles defect, provide the experimental basis for the research on the repair of urinary tract defection and future clinical studies。

干细胞作为较理想的种子细胞，广泛应用于组织工程学方面的研究，包括泌尿器官缺损的修复。科学界已经用干细胞及脱细胞支架等生物材料成功修复组织器官的缺损。下一步就是发现及确定一些起关键作用的条件及因子，更系统地阐明组织工程涉及的相关分子机制。我们亦在国内外研究的基础上，制备出无毒性、有很好的生物相容性的膀胱脱细胞基质，并与毛囊干细胞成功共培养。将生长在膀胱脱细基质支架上的毛囊干细胞植入到膀胱缺损处后，毛囊干细胞在膀胱周围微环境的作用下分化为平滑肌细胞，修复了膀胱缺损。为提高诱导效率，控制诱导不良事件的发生，我们设计此研究，进一步了解在这过程中的作用机制，应用最新的研究方法，阐明miR-145在毛囊干细胞为种子细胞修复膀胱缺损平滑肌修复中的作用机理，为泌尿道缺损修复的基础研究及将来的临床研究提供实验基础。

前期研究中，团队发现毛囊干细胞（HFSCs）通过诱导培养，可以分化成为平滑肌细胞（SMC），并体现出良好的膀胱修复潜力。进而，研究团队为明确HFSCs分化成为SMC过程中的可能作用机制，开展了本项目的研究工作。研究结果显示：（1）检测诱导后1,3,5,7天的miR-145表达水平，结果显示随着时间进展miR-145的表达量逐步升高。分别合成了miR-145模拟物及抑制物慢病毒，构建了稳转株，同时对miR-145模拟物组、miR-145抑制物组和对照组进行诱导培养，发现miR-145模拟物组a-SMA及SM-MHC的mRNA表达水平明显高于对照组及miR-145抑制物组（P＜0.05），同时miR-145抑制物组的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步检测了各组不同时间a-SMA及SM-MHC的表达水平，趋势及结果与mRNA表达水平一致。（2）通过不同miRNA靶标预测网站对miR-145的下游靶标基因进行预测，选出KLF-4作为可能下游靶点，进行荧光素酶报告基因实验，结果证实miR-145-5p能够靶向调控KLF-4的表达，miR-145模拟物组、miR-145抑制物组和对照组中KLF-4 mRNA的表达水平也存在显著差异（P＜0.05），且与miR-145表达水平成负相关。通过进一步实验，发现下调KLF-4组与miR-145模拟物组a-SMA及SM-MHC的表达水平相较对照组明显升高，但两组间无明显差异（P＞0.05）。通过Pathway Card关联并经过实验验证，TGF-β/SMAD通路为KLF-4的下游作用通路。（3）使用miR-145模拟物组、miR-145抑制物组及对照组细胞系复合膀胱脱细胞基质构建了生物补片，对膀胱缺损动物模型进行了手术修补，在术后饲养相同时间条件下，miR-145模拟物组补片区a-SMA及SM-MHC的表达水平明显高于miR-145抑制物组及对照组（P＜0.05），但miR-145抑制物组及对照组间无明显差异（P＞0.05），同时miR-145模拟物组在术后早期（2、4周）相同时间的膀胱容量明显大于miR-145抑制物组及对照组，但随着时间进展，三组间膀胱容量无明显差异（P＞0.05）。总之，miR-145能够靶向抑制KLF-4的表达并通过调控TGF-β/SMAD通路影响HFSCs向SMC分化的进程。