Smad2在急性肾损伤中的保护作用及机制研究

Acute kidney injury (AKI) is a clinical syndrome characterized by a rapid loss of renal function, but the underlying mechanism is still obscure. It is well accepted that TGF-β/Smad signaling drives renal fibrosis, however, its function in AKI is still controversial. Despite the majority reported TGF-β1 as a protective molecule in AKI, our pilot study indicated that knockout of Smad3 did attenuate infiltration of inflammatory cells while ameliorating apoptosis of tubular epithelial cells (TEC) to prevent renal injury. It is noticeable that Smad2, another critical downstream of TGF-β1, was hyperactivated in S3KO injured kidney, with its function undetected. Considering our recent finding that Smad2 protected against renal fibrosis by negatively regulating the function of Smad3, we hypothesized that Smad2, rather than Smad3, may mediate the protective role of TGF-β in AKI. This hypothesis will be tested in vivo in Smad2 conditional knockout mice with cisplatin-induced AKI and in vitro in Smad2 knockdown/overexpression TECs in response to cisplatin and the underlying mechanism will be further detected. Collectively, dissection of downstream molecules of TGF-β will provide us an insight view on the physiopathology of acute kidney injury while indicating the potential therapeutic target for clinic use.

急性肾损伤（AKI）是一组以突发性肾功能下降为特征的临床综合征，但其机制未明确。TGF-β及下游Smad2/3决定肾纤维化进程，但在AKI中的作用却有争议。多数观点认为TGF-β保护AKI，但预实验发现敲除Smad3反而减轻AKI的肾损害且引起Smad2的过度激活，提示Smad2可能有不同于Smad3的功能。本课题组近期研究表明Smad2亦可负调控Smad3信号减轻肾纤维化。因此我们假设Smad2（而非Smad3）介导了TGF-β对AKI的保护作用。课题组拟在Smad2条件性敲除小鼠上诱导AKI模型，评估Smad2对肾功能的作用，同时检测其对炎症、凋亡等病理过程的调节及它与Smad3的相互调控，并与体外进一步探讨机制。综上所述，TGF-β下游通路的复杂性决定了它在AKI中的多重作用，因而剖析其下游Smad2和Smad3的功能及相互关系，有助于阐明AKI的发病机制并为药物设计提供新靶点。

TGF-β/Smad信号通路是纤维化疾病公认的重要调控因子，新的证据表明，它可能也参与了急性肾损伤（AKI）的过程，但确切的机制尚不明确。课题组前期研究成果表明Smad2可以抑制TGF-β/Smad3介导的肾纤维化，但其在急性肾损伤中的功能及作用机制却有待证实。因此本项目拟构建Smad2肾脏条件基因敲除小鼠及Smad2沉默和过表达的肾小管上皮细胞株，并建立体内外肾毒性急性肾损伤模型，观察Smad2在急性肾损伤中的功能并进一步探讨其分子机制。..课题组研究结果显示，条件性敲除Smad2抑制顺铂引起的肾脏病理损害及肾功能损伤，此外，条件性敲除Smad2下调肾脏损伤分子（KIM-1）的蛋白和mRNA水平。体外实验同样证实，沉默Smad2表达降低（而过表达Smad2增加）顺铂诱导的小管上皮细胞KIM-1表达水平，共同提示Smad2可能具有促AKI作用。..课题组进一步开展了机制方面的研究。众所周知，急性肾损伤主要的病理特点包括炎症和小管上皮细胞的程序性死亡。本研究表明，条件性敲除Smad2抑制F4/80+巨噬细胞的浸润和炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1等）、趋化因子（如MCP-1等）的表达，这可能与Smad2缺失减少p65 NF-κB的磷酸化水平有关。在顺铂处理的肾小管上皮细胞中，沉默Smad2下调炎性细胞因子的mRNA水平、p65NF-κB的磷酸化及其启动子活性水平；与之相对应的是，过表达Smad2促进NF-κB介导的炎症反应。此外，流式细胞术检测结果表明，沉默Smad2减少顺铂引起的细胞凋亡和程序性坏死。本研究进一步发现，沉默Smad2显著降低顺铂诱导的p53磷酸化水平和启动子活性水平，同时减少cleaved caspase-3的含量。此外，沉默Smad2抑制RIP1 / RIP3 / MLKL轴介导的程序性坏死信号通路，这些结果均在Smad2过表达的肾小管上皮细胞中得到反向验证。值得注意的是，虽然Smad2沉默上调Smad3磷酸化及启动子活性水平，但分别沉默Smad2和Smad3均可以限制AKI的进程，表明Smad2的促AKI作用可能与Smad3无关，其具体机制将有待于进一步探索。..综上所述，Smad2可诱导炎症反应和上调肾小管上皮细胞程序性死亡的敏感性，进而促进顺铂诱导的急性肾损伤，本研究为开发以TGF-β/Smad为靶点的AKI防治方法提供了理论依据。