甜瓜果实α-甘露糖苷酶基因的克隆及其在果实成熟软化中的功能分析

α-甘露糖苷酶是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶,在植物果实发育成熟及软化过程中起着重要作用。本项目以典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜为研究对象，分析果实发育成熟过程中α-甘露糖苷酶活性变化规律及其基因的表达特性，应用RACE技术克隆α-甘露糖苷酶基因全长cDNA，应用RNAi技术和基因过量表达技术，研究该基因在甜瓜果实发育成熟及软化中的功能及其作用机理，从糖代谢途径揭示甜瓜果实发育成熟的分子机理，具有重要的理论意义。虽然对激素调控植物果实发育成熟的分子机理的研究较多,但对糖代谢途径调控植物果实发育成熟及软化的研究较少。本项目将首次研究α-甘露糖苷酶基因在甜瓜果实发育成熟及软化中的功能，从一个新的视野阐明甜瓜果实发育成熟的分子机理，其学术思想有一定的创新性。

α-甘露糖苷酶是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在植物果实发育成熟及软化过程中起着重要作用。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料，利用RT-PCR方法从果实中克隆得到了α-甘露糖苷酶基因（α-Man）全长cDNA，序列分析显示，序列长度为3132 bp，编码1020氨基酸。对甜瓜不同发育时期果实的α-甘露糖苷酶活性及其基因的表达情况进行了分析测定，随着授粉天数的增加，酶活性逐渐增高，到DAP40（授粉后天数，Day after pollinate，DAP）酶活性达到最大，DAP45时下降。基因的表达模式与酶活性相似，随着授粉后天数的推移，α-甘露糖苷酶基因的表达量逐渐增加，到DAP40表达量达到最大，DAP45时下降。分别构建了α-Man基因的超表达载体pPZP221-Man、RNAi载体pART-Man1和pART-Man2，应用花粉管通道法转化技术将其导入甜瓜，经PCR检测初步证明外源基因已经整合到受体植物的基因组中。经过PCR检测及表型筛选分别获得了T3代转基因植株。与未转基因对照甜瓜相比，转超表达载体的甜瓜果实提前7d成熟，转RNAi载体的甜瓜果实成熟期和采后贮藏期显著延长。对不同发育阶段的T3代转基因果实进行了α-甘露糖苷酶活性测定，结果显示，转超表达载体的甜瓜果实的酶活性高于未转基因对照果实，而转RNAi载体的甜瓜果实的酶活性低于未转基因对照果实。利用实时荧光定量方法分析了转基因果实中α-Man基因及成熟相关基因表达量，结果显示，转超表达载体的甜瓜果实中α-Man基因及成熟相关基因表达量显著提高；转RNAi载体的甜瓜果实中α-Man基因和成熟相关基因表达量明显下降。这些研究结果表明，甜瓜α-Man基因在甜瓜果实发育成熟过程中具有促进成熟的作用，在耐贮藏基因工程中具有潜在的应用价值。