小菜蛾对阿维菌素抗性相关P-糖蛋白基因的筛选及功能分析

小菜蛾对阿维菌素抗性与表皮穿透作用降低、解毒酶系活性提高和靶标位点变异等多因素有关，但目前的研究结果尚不能完全解释其抗性机理，其它重要的抗性相关因素有待进一步探明。P-糖蛋白(Pgp)属于ABC转运蛋白超家族，主要功能是利用ATP水解的能量将与其结合的药物逆浓度泵出细胞，降低细胞内药物浓度而产生抗性，Pgp的过量表达在一些多抗性害虫和伊维菌素抗性线虫中起重要作用。本研究拟克隆阿维菌素敏感和抗性小菜蛾Pgp基因，进行SNP位点筛查，筛选与抗性相关的Pgp 基因；荧光定量分析Pgp基因在不同龄期和不同抗性品系中表达量的差异；将Pgp基因在昆虫细胞(SF+)中表达后层析纯化，同时直接从虫体内分离纯化Pgp；将纯化的Pgp与蛋白磷脂体重组，研究其与阿维菌素等药剂的亲和特性，采用荧光底物研究其转运功能等，旨在明确Pgp在抗性中的作用，阐明小菜蛾对阿维菌素的抗性机理，同时为抗性逆转剂的研发提供依据。

从阿维菌素敏感和抗性小菜蛾体内获得的P-糖蛋白基因命名为PxPgp1，该蛋白的N-端在细胞内，包括12个跨膜区。利实时荧光定量技术，检测发现PxPgp1在小菜蛾的整个生命过程中表达，其中，在幼虫期表达量不断升高，在雄性成虫中表达量比其他龄期均高，在中肠中表达量最高，在头和表皮中的表达量很低。尽管在抗性品系中未发现稳定的突变位点，但该基因在抗性品系中的表达量显著高于敏感品系，并且对低剂量阿维菌素有应激反应。初步构建了ABCB1基因真核表达载体与原核表达体系。测定了阿维菌素敏感和抗性品系小菜蛾的转录组，共获得48G的数据量，共发现新基因11217个；新发现ABC转运蛋白15个，P450基因16个和谷胱甘肽转移酶12个。发现有一P450家族基因显著上调，克隆并获得该基因的全长，国际命名委员会命名为CYP340W1基因。CYP340W1基因在各个龄期都有表达，在头部的表达量最高，抗性品系CYP340W1的表达量显著高于敏感品系；CYP340W1基因能够被阿维菌素诱导表达。对该基因进行RNA干扰后6小时表达量显著下降，持续到18小时，24小时开始恢复。干扰后生物测定结果显示，干扰该基因后死亡率比对照组显著上升，表明CYP340W1可能与小菜蛾阿维菌素抗性相关。.综上所述，小菜蛾对阿维菌素产生中等抗性水平时，抗性由多因子控制。PxPgp1基因和CYP340W1基因的上调表达在抗性中均起一定作用。