基于新疆药用植物一枝蒿筛选新型的免疫佐剂及其作用机制研究

As a traditional Uygur medicine, Artemisia rupestris L. (Compositae) is widely distributed in Xinjiang，Artemisia rupestris L. contains a large number of flavonoids, which is the key bioactive ingredient. The flavonoids compound of Chinese herbal medicinal ingredients displays adjuvant activity, it can increase specific immune response and non-specific response. We have found that the the crude extract in Artemisia rupestris L. can upregulate the expression level of co-stimulation molecular on dentritic cells(DCs).In this project, in order to analyze the adjuvant activity and safety of the flavonoids compound in Artemisia rupestris L.，DCs and animal will be used in the adjuvant activity determination of the flavonoids compound occurring in the extract from Artemisia rupestris L., and the mechanism of the adjuvant activity will be researched. The project contents are below:(1) The preparative isolation and purification of the crude extract of Artemisia rupestris L.by chromatography methods;(2) The detection of the adjuvant activity and safety of the crude extract of the flavonoids compound;(3)The preparative isolation and structural identification of the monomeric compound in the extract of Artemisia rupestris L.; (4) The study of the adjuvant activity and the mechanism of monomeric compound in flavonoids of Artemisia rupestris L.;(5）The safety analysis of potential new-type immunne adjuvant. In conclusion, this study will be expected to obtain a new-type immunologic adjuvant to substitute for oil adjuvant for human and animal, it will be developed a novel method for screening new type immune adjuvant with high efficiency, low toxicity, and it also give a new idea of utilization herbal source in Xinjiang.

新疆一枝蒿全草中黄酮类化合物含量较高且为主要活性成分，黄酮类化合物对机体具有免疫调节作用。前期研究发现一枝蒿提取物对DCs表面的共刺激分子有明显上调作用。鉴于此，本研究利用一枝蒿作为研究对象，采用体外培养的树突状细胞作为候选佐剂体外快速筛选平台，用动物模型作为候选佐剂体内筛选平台，对一枝蒿黄酮类化合物及其单体的佐剂效应进行体外体内检测和安全性评价，并对其佐剂的作用机制进行探讨。包括：（1）一枝蒿总黄酮的分离提取及纯化；（2）一枝蒿总黄酮粗提物佐剂效应的体外和体内筛选；（3）进一步分离纯化总黄酮中各单体，利用体外和体内筛选平台检测其佐剂效应，并进行结构鉴定；（4）一枝蒿总黄酮和各单体中候选佐剂作用机制研究；（5）候选佐剂急性毒性动物试验确定其安全性。以期筛选出可以临床应用的安全、高效新型免疫佐剂，建立一种从天然药用植物中寻找新型免疫佐剂的筛选平台，为更好开发利用新疆药用植物资源提共新思路。

中草药由于具有很好的免疫调节活性和安全性而成为新型疫苗佐剂筛选的理想材料。本研究以新疆一枝蒿提取物为候选佐剂的研究材料，通过体外和体内检测平台检测其佐剂效应和安全性评价，并对佐剂的作用机制进行了初步探讨，以期筛选出可以临床应用的安全、高效新型免疫佐剂。主要研究内容包括：（1）新疆野生和栽培一枝蒿醇提物和水提物的粗提制备和安全性实验；（2）利用体外DCS平台检测醇提物和水提物佐剂效应；（3）利用动物实验通过不同免疫途径确定一枝蒿醇提物配伍OVA抗原，水提物分别配伍OVA疫苗，FMDV疫苗和流感疫苗筛选确定佐剂活性好的提取物成分，并进行作用机制初步研究；（4）进一步分离和纯化佐剂活性好的成分，并进行结构表征鉴定。取得的主要研究结果如下：（1）成功制备了水提物和醇提物，野生及栽培一枝蒿水提物中多糖含量分别为26.18% 和22.14%，野生及栽培一枝蒿醇提物中黄酮类化合物含量分别为16.4% 和10.25%；体内急性毒性动物实验表明一枝蒿水提物和醇提物在一定剂量范围内对小鼠无毒副作用。（2）通过体外DCs平台探讨了新疆野生和栽培一枝蒿醇提物和水提物在一定剂量内能够显著促进DCs表面分子和细胞因子表达；一枝蒿水提物能够增强异源T细胞增殖，降低DCs抗原吞噬能力，从而促进DCs成熟和功能；水提物的佐剂活性优于醇提物。（3）以OVA为抗原通过皮下和肌肉途径免疫动物，野生和栽培水提物及醇提物均能够增强体液和细胞免疫反应，具有很好的佐剂活性，水提物优于醇提物，肌肉途径优于皮下途径。（4）野生一枝蒿水提物分别配伍FMDV疫苗和流感疫苗，通过皮下和肌肉途径免疫动物，结果表明野生一枝蒿水提物作为FMDV疫苗的佐剂具有很好的免疫增强作用，作为流感疫苗的佐剂不仅能够增强免疫反应，也能够节约抗原用量10倍。（5）野生一枝蒿水提物促进DCs成熟及功能的机制探讨，结果表明野生一枝蒿水提物促进DCs成熟可能是通过激活DCs表面受体TLR4及其下游MAPK和NF-κB信号通路促进DCs成熟和功能。本研究通过体外和体内检测平台，以不同疫苗为抗原，通过不同免疫途径筛选了一枝蒿提取物中具有良好佐剂活性的成分，并对其进行了纯化和表征鉴定，这些研究结果可以为新型疫苗佐剂的深入研究和开发奠定基础。