Sema3A/Nrp1介导真皮间充质细胞抑制急性移植物抗宿主病的机制研究

Graft versus host disease（GVHD） is the main complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Because of the unsatisfactory treatment now, mesenchymal stromal cells have a good treatment prespective. Dermal mesenchymal stromal cells （DMSCs） is the ideal source of cells. In the previous study, we confirmed that DMSCs inhibit acute GVHD by suppressing the activation and proliferation of T cells. Mesenchymal stromal cells derived from different source have different mechanism of immunoregulation. Compared with bone marrow mesenchymal stromal cells, the expression level of Sema3A secreted by DMSCs was higher. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were co-cultured in the presence of neutralizing Sema-3A antibodies. The blockade of Sema-3A secreted by DMSCs restored the proliferation of PBMCs. Previous study showed that Sema3A combined with its receptor Nrp1 could inhibit ZAP70 activation which play the vital role in T-cell activation. According to this, we hypothesize that " Sema3A/Nrp1 mediated dermal mesenchymal stromal cells suppressing the activation and proliferation of T cells to inhibit acute graft-versus-host disease ". This study will investigate the effect and signalling pathway of Sema3A secreted by DMSCs on activation and proliferation of T cells, and confirm that Sema3A/Nrp1 mediate DMSCs inhibiting acute GVHD in animal experiments. This study will clarify the mechanism of DMSCs inhibiting acute GVHD and provide a new method and target for treatment of acute GVHD.

移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植的主要并发症，目前治疗仍不理想，间充质细胞有巨大的治疗前景。真皮间充质细胞（DMSC）是理想的细胞来源，前期我们首次证实DMSC通过抑制T细胞活化增殖抑制急性GVHD。不同来源的间充质细胞免疫调节的机制不同，与骨髓间充质细胞相比，DMSC的信号素3A（Sema3A）表达水平更高，加入其抗体能明显恢复与DMSC共培养的淋巴细胞的增殖。有研究显示Sema3A与受体Nrp1结合抑制ZAP70活化，ZAP70在T细胞活化中起关键作用。据此提出“Sema3A/Nrp1介导真皮间充质细胞抑制T淋巴细胞活化增殖，抑制急性GVHD”的假说。本研究拟探讨DMSC分泌的Sema3A对T细胞活化增殖的作用及信号通路；在动物试验中证实Sema3A/Nrp1介导DMSC抑制急性GVHD。阐明DMSCs抑制急性GVHD的作用机制，为急性GVHD的治疗提供新的方法和靶点。

本课题通过慢病毒转染筛选获得了稳定低表达和高表达Sema3A的人源真皮间充质细胞（DMSC）。体外试验发现：1.与不同的DMSC共培养后T细胞增殖均明显受抑，其中与高表达Sema3A的DMSC（ov3A-DMSC）共培养的T细胞增殖降低最明显，提示Sema3A在DMSC抑制T细胞增殖中起到了重要作用，但DMSC分泌Sema3A的水平不影响T细胞凋亡；ov3A-DMSC较低表达Sema3A的DMSC（si3A-DMSC）更加明显地阻滞T细胞于G0/G1期，更加明显地抑制细胞周期蛋白CDK4和CyclinD1的表达，但对细胞周期抑制蛋白p27无影响，提示Sema3A通过抑制CDK4和CyclinD1的表达介导DMSC阻抑T细胞进入增殖周期。2. ov3A-DMSC较si3A-DMSC明显抑制了Th17细胞比例，降低Th1/Th2，上调Treg细胞比例；提示Sema3A通过调节T细胞亚群发挥免疫抑制作用；ov3A-DMSC较si3A-DMSC明显抑制炎症因子TNFα、IFNγ和IL-13的表达，抑制T细胞分泌IL-17，促进T细胞IL-10和IL-13的表达。提示Sema3A也通过抑制T细胞炎症因子的释放，促进T细胞抗炎因子的表达发挥免疫抑制作用；3. Sema3A的高表达抑制了ZAP70 磷酸化，RAS/MAPK 信号通路和 NF-κB的活化，提示Sema3A介导DMSC抑制T 细胞活化增殖的重要信号通路；4.在小鼠模型中证实，联合输注ov3A-DMSC能更加明显的抑制急性GVHD的发生，增加Treg细胞比例，降低Th1细胞和Th17细胞比例，提示Sema3A通过调节T细胞亚群介导DMSC抑制急性GVHD的发生。本课题阐明了DMSC分泌的Sema3A对T细胞活化增殖的作用及信号通路；在动物试验中证实Sema3A/Nrp1介导DMSC抑制急性GVHD，为急性GVHD的治疗提供了新的方法和靶点。