基于抗炎活性成分群的中国“杨树型”蜂胶质量评价体系研究

Propolis has numerous biological properties for preventing diseases and promoting health. However, the therapeutic effects of propolis are not stable and its material basis is not fully understood. This is because the quality control and evaluation system of propolis needs to be perfected. We previously separated and purified 11 chemical components from water soluble propolis by semi-preparative high performance liquid chromatograph (PHPLC). The biological activities of these components had been preliminarily studied through different cell models, showing that different components had different effects. We speculated that the biological activities of propolis do not depend on a single component, and a “bioacitve components group” might play a key role. It is not clear whether the “bioactive components group” with different pharmacological activities is the same, and whether the “bioactive components group” with the same pharmaceutical activities is the same in different cell models. In this study we will focus on the anti-inflammatory effects of propolis. Based on the natural components screening through different inflammatory cell models, we will establish a spectrum-activity relationship to elucidate the “material basis of pharmaceutical effects” of the anti-inflammatory activity of propolis. Through online HPLC testing together with PHPLC, we prepare and explore the “candidate bioactive components group” of the anti-inflammatory effects of propolis. We aim to establish quality control and evaluation system for propolis which can be marked by “bioactive components group”, and provide basis for other bioactive quality standards.

蜂胶具有多种药理学活性，但应用中最大的困难就是药效不稳定，药效物质基础不明确，究其原因是蜂胶质量控制体系仍不完善。本课题组前期通过半制备型高效液相色谱（PHPLC）分离纯化了蜂胶水溶物中11种组分，通过不同细胞模型对其活性进行初筛，发现不同组分功效不同，我们推测蜂胶药理学活性不是单一组分发挥功效，而存在一个“活性成分群”。蜂胶发挥不同药理学功效的“活性成分群”是否相同，以及同一药理学活性在不同细胞模型中“活性成分群”是否相同均不明确。本课题将以蜂胶抗炎活性为突破口，在蜂胶固有成分表征的基础上，通过不同的炎症细胞模型，建立“谱-效”关系，明确蜂胶抗炎功效的药效物质基础，并通过在线高效液相色谱结合PHPLC，制备蜂胶抗炎功效的“候选活性成分群”，进而深入发掘蜂胶发挥抗炎功效的“活性成分群”，以期建立以“活性成分群”为标示量的蜂胶抗炎质量控制评价体系，为蜂胶其它活性质量标准的建立提供依据。

采用大孔吸附树脂粗分离结合半制备型高效液相色谱法对蜂胶水溶部位的主要组分进行分离、纯化，得到11种化合物分别是：咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、 短叶松素、咖啡酸苄酯、 咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素。接着用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和细菌内毒素（LPS）分别诱导两种炎症细胞模型，对11种化合物的抗炎活性进行检测，发现蜂胶中这11种组分不同程度地表现出抗炎功效。接着我们对蜂胶水提物的残渣经乙酸乙酯浸提，然后经40-90%不同浓度的甲醇-水洗脱，得到8段组分（Ⅰ-Ⅷ）。其中，对分离到的8段组分的化学成分通过HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析进行了检测。8段组分分析表明，8段中的化学组分和含量并不完全相同。接着，我们用ox-LDL和LPS分别诱导的两种炎症细胞模型对分离得到的8段组分的抗炎功效进行了体外检测，发现8段组分均表现出不同程度的抗炎功效。同时我们用11种单体和8段组分进行了其抗肿瘤的对比实验。发现蜂胶的抗肿瘤功效与抗炎功效组分不同，蜂胶的抗肿瘤功效组分主要是黄酮类化合物决定的，而蜂胶的抗炎功效是酚酸以及黄酮类化合物多种成分共同作用的结果。据此，我们推测蜂胶的主要抗炎的功效组分是非常复杂的，很可能是多种成分如酚酸和黄酮类化合物共同作用的结果。因此，我们接下来分别在两种炎症细胞模型上进行了蜂胶抗炎作用机理研究，发现蜂胶对ox-LDL刺激的内皮细胞炎症的保护功效主要是通过抗氧化，降低活性氧水平，升高线粒体膜电位，激活PI3K/Akt/ mTOR信号通路，钝化LOX-1和p38MAPK磷酸化水平，进而抑制ox-LDL刺激的HUVECs细胞炎症的凋亡和自噬。在LPS诱导的炎症细胞模型中，发现蜂胶对LPS刺激的内皮细胞保护功效主要是通过降低活性氧水平，保护线粒体膜电位，降低MAPK信号通路，进而抑制p53从细胞质进入细胞核，抑制细胞自噬，进而抑制炎症发生。本项目研究为蜂胶的质量控制提供了一定实验依据。