仔猪肠壁优势乳酸杆菌黏附相关S蛋白功能与结构域解析

益生素作为无残留、保健添加剂广泛应用于畜禽养殖，但其存在最主要问题是利用效果不一，根源在于益生菌种肠道黏附能力差异。乳酸杆菌为应用最早、研究最多的益生菌种之一，研究表明细菌表面蛋白（S蛋白）在乳酸杆菌肠道黏附中起关键作用。本研究拟运用变性梯度凝胶电泳（DGGE）结合传统微生物学方法，从仔猪肠壁分离获得优势乳酸杆菌菌株；利用肠道细胞Caco-2体外培养体系，检测菌株竞争排斥病原菌黏附的定植抗力反应菌株黏附作用的微生态效应，通过去除S蛋白后菌株黏附能力变化分析S蛋白在黏附中功能作用；采用SDS-PAGE电泳和杂交分离黏附相关S蛋白并进行质谱鉴定和序列分析，结合生物信息学分析解明其黏附作用的关键结构域。旨在查明仔猪肠壁自然黏附且居优势乳酸杆菌具备怎样的黏附相关S蛋白及其功能作用与结构域特征，为益生菌种肠道黏附能力的分子改造提供理论指导和前期基础，对筛选和培育仔猪高效乳酸杆菌等益生菌意义重大。

本研究从仔猪肠壁分离结合利用肠道细胞体外粘附分析，鉴定获得高粘附力乳酸杆菌菌株，检测菌株竞争排斥病原菌黏附肠道细胞的定植抗力，通过去除S蛋白后菌株黏附能力变化分析S蛋白在黏附中功能作用，采用SDS-PAGE电泳和杂交分离黏附相关S蛋白并进行质谱鉴定和序列分析，结合生物信息学分析解明粘附关键结构域。主要成果如下：.1、分离获得高粘附乳酸杆菌菌株：从仔猪肠道分离并结合16SrDNA序列测定和同源性分析，获得37株乳酸杆菌。通过Caco-2细胞粘附能力分析，鉴定获得高粘附能力乳酸杆菌5株，即为 L. reuteri ZJ616, L. reuteri ZJ617, L. reuteri ZJ621, L. reuteri ZJ623和L. salivarius ZJ614。.2、高黏附力乳酸杆菌的抑制病原菌的功能分析：分析发现高粘附力乳酸杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌粘附肠道细胞存在明显抑制作用，在竞争（乳酸杆菌和病原菌同时加）、排斥（乳酸杆菌先加）和驱除（乳酸杆菌后加）条件下都显著降低病原菌的粘附数量，显示高粘附力乳酸杆菌调控肠道微生态的功能作用。.3、阐明表面蛋白在乳酸杆菌粘附肠道细胞中具有重要作用：通过去除和未去除表面蛋白比较分析发现，乳酸杆菌在去除表面蛋白后，在竞争、排斥或驱除下对大肠杆菌或沙门氏菌抑制能力下降；SDS-PAGE分析发现高粘附力乳酸杆菌比低粘附乳酸杆菌具有更丰富的表面蛋白；显示表面蛋白在乳酸杆菌肠道粘附功能中的重要作用。.4、乳酸杆菌关键表面蛋白及粘附结构域解析：通过表面蛋白与肠细胞杂交分析，显示高粘附乳酸杆菌存在约40kDa粘附性蛋白条带；通过质谱鉴定、测序分析和杂交检测证实该蛋白为GADPH；蛋白的免疫电镜定位分析显示GADPH存在于乳酸杆菌的表面；通过引物扩增和表达，纯化获得该蛋白；根据蛋白序列模型分析，乳酸杆菌粘附性表面蛋白GADPH主要存在a-螺旋、β-片状折叠及片状结构，发挥粘附性作用的17个关键氨基酸主要位于非螺旋区域，空间位置相近，构成立体的空间粘附结构域。.项目发表文章6篇，会议论文1篇，授权专利1项，专著1本，获省级科技三等奖1项。项目解析了仔猪肠壁高粘附力乳酸杆菌表面蛋白在粘附中的功能作用，发现高粘附力乳酸杆菌存在的表面蛋白GADPH及其粘附结构特征，为乳酸杆菌粘附能力分子改造奠定基础，对培育乳酸杆菌等益生菌具有显著意义。