N-花生四烯酰多巴胺靶向抑制NRAS突变白血病细胞的分子机制研究

RAS oncogene is among the most common drivers in human cancers, including around 15% hematologic malignancies that bear RAS oncogenic mutations. To date, however, no effective therapies or drugs have reached the clinic due to the tremendous difficulties in targeting RAS oncoproteins directly. Thus, novel therapeutic targets or pathways for attacking RAS-driven cancers are in urgent demand. We have previously screened out a bioactive lipid, N-arachidonoyl dopamine, which could selectively impair the spatial organization and intracellular transport of oncogenic NRAS proteins by suppressing their plasma membrane translocation and trapping them in the endomembrane systems including Golgi apparatus. Also, NADA specifically inhibits NRAS neoplastic transformation and induces oncosis-like necrosis in NRAS-mutant leukemia cells. Nevertheless, the underlying mechanism remains unclear. In this proposal, aiming to dissect molecular mechanism for the NADA induced oncogenic NRAS intracellular redistribution and regulated cell death, we plan to uncover the potential targeted genes by utilizing a genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screen in the NADA-resistant cells, identify molecules that directly interact with NADA by using a click-chemistry based probe, and profile the differential proteomics that are spatially affected by NADA treatment by using the subcellular organelle fractionation methods combined with quantitative mass spectrometry-based technology. This study will help to develop novel drug targets or therapeutic strategies against NRAS-related hematologic malignancies.

RAS是最常见的肿瘤驱动基因之一，约15%血液肿瘤中存在其突变。但RAS蛋白成药性差，至今临床上尚无有效靶向药物。因此，寻找新的药物靶标或通路是RAS肿瘤治疗领域的首要任务。我们前期研究发现，N-花生四烯酰多巴胺（NADA）可以选择性干扰NRAS突变蛋白细胞内的空间分布和转运，将细胞质膜定位的NRAS突变蛋白阻滞在包括高尔基体在内的细胞内膜系统中。同时，NADA特异抑制NRAS突变的白血病细胞转化并引起胀亡样细胞坏死。但其内在分子机制尚不清楚。本项目将通过全基因组CRISPR/Cas9基因敲除筛选NADA耐药细胞，确定其潜在靶基因；利用基于点击化学标记的分子探针，鉴定其直接相互作用分子；利用亚细胞器组分分离联合质谱分析，描绘受NADA空间性调变的差异蛋白质组，从而解析NADA抑制NRAS突变蛋白胞内转运并引起调节性细胞死亡的分子机制，为NRAS相关血液肿瘤的靶向治疗提供新的药物靶点和策略。

RAS家族癌基因（KRAS, HRAS, NRAS）是最常见的肿瘤驱动基因，约30%的人类肿瘤中存在其突变。其中，NRAS基因突变是血液肿瘤中最高频的热点突变之一，主要分布在多发性骨髓瘤（MM, 42-50%）、急性髓系白血病（AML, 12-21%）、骨髓增殖性肿瘤（MPN, 25-30%）、急性B淋巴细胞白血病（B-ALL, 10-15%）、急性T淋巴细胞白血病（T-ALL, 9-20%）等多种恶性血液肿瘤中。临床上，NRAS突变白血病患者的预后相对较差，5年生存期低于40%。然而由于RAS蛋白成药性差，临床上尚无靶向NRAS的药物。因此，寻找新的药物靶标或通路是改善NRAS白血病治疗的关键。我们前期研究发现，N-花生四烯酰多巴胺（NADA）可以选择性干扰NRAS突变蛋白细胞内的空间分布和转运，将细胞质膜定位的NRAS突变蛋白阻滞在包括高尔基体在内的细胞内膜系统中。同时，NADA特异抑制NRAS突变的白血病细胞转化并引起胀亡样细胞坏死。为解析其内在分子机制，本项目利用基于点击化学的分子探针标记技术，鉴定并描绘了细胞内NADA相互作用蛋白谱，发现NADA靶分子主要参与了细胞死亡和细胞内膜泡运输这两个关键的生物学过程中。由此，我们对这两部分研究内容分别进行深入探究。关于细胞死亡部分，质谱结果显示细胞焦亡关键分子胃泌素D(GSDMD)是潜在的NADA靶分子，同时我们也证实白血病细胞在NADA短时间处理后GSDMD分子即可被Caspase-1剪切而激活，从而在细胞膜打孔，导致细胞内外渗透压改变、进水肿胀起泡而死亡。关于膜泡运输部分，我们发现NADA特异作用于高尔基体和胞内体，影响这些亚细胞器结构，尤其是我们发现参与NRAS棕榈酰化修饰的高尔基体蛋白GOLGA7也是一个高可信度的NADA靶分子。我们通过CRISPR-CAS9技术敲除GOLGA7能特异性抑制NRAS依赖的细胞增殖并影响NRAS质膜定位。同时我们发现完全敲除Golga7的小鼠是胚胎致死的，而在小鼠成年后再诱导全身性敲除Golga7后并没有显著异常表型，提示了靶向Golga7的肿瘤药物相对安全。我们目前正在重点研究GOLGA7在NRAS突变白血病发生发展中的作用和机制，同时我们也在解析蛋白质复合体结构并筛选相应的小分子抑制剂，为推动GOLGA7作为抗NRAS突变白血病的新靶点走向临床转化提供实验依据和理论基础。