BmNPV广东分离株orf126增加多角体产量机理研究

昆虫杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白具有良好的生物活性,广泛应用于生物医药等方面研究，如何增强该系统外源蛋白表达量是许多实验室及生物公司研究的热点。前期研究发现家蚕核型多角体病毒(BmNPV)广东分离株orf126(GD126)能够增加感染幼虫及细胞内多角体的产量，但其作用机制尚不清楚。本研究拟利用点突变对GD126中的RGD基序进行研究，检测由突变引起的生物学功能的差异，确定GD126在杆状病毒感染中的作用；利用抑制性消减杂交方法构建GD126感染细胞的cDNA文库，分析比较其中差异性表达的病毒因子和细胞因子，阐明GD126作用机制；并利用报告基因进一步确认GD126增强蛋白表达量是否具有广谱性。预期结果可以确定RGD基序在 GD126回复病毒感染宿主细胞中的作用，从而揭示GD126的作用机制，丰富和发展杆状病毒感染的分子机制，并为优化改造家蚕核型多角体病毒表达系统提供理论支撑。

杆状病毒是专一感染鳞翅目等昆虫的病原微生物，在生物农药及生物医药方面得到广泛应用。前期研究发现中国不同地方分离株家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126(Bm126)基因具有多样性，所有Bm126序列编码的氨基酸序列N端都有一段疏水性很强的氨基酸，C端都有一个C6的基序，二者之间的一段多肽不同分离株序列不同：以陕西分离株为代表Bm126(简称SX126)编码的这段多肽含有6个ND(天冬酰胺-天冬氨酸)的重复序列，以广东分离株为代表的Bm126(简称GD126) 编码多肽则形成一个RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的基序，RGD基序是细胞底物黏附分子的基本识别结构，介导信号转导等多种生物学过程。病毒学研究发现在病毒感染过程中含有GD126的病毒较含有SX126的病毒能显著增加细胞和家蚕多角体产量。 .本研究中首先利用点突变技术构建RGD基序突变的GD126重组病毒，分析RGD在病毒感染中是否有增加多角体数量作用；再用高通量测序分析含有不同Bm126的病毒感染细胞后病毒因子以及细胞因子差异表达，以明确其作用机理；最后利用报告基因明确GD126是否对外源蛋白的表达具有增强作用。.结果发现，GD126中RGD的突变对BmN细胞中多角体产量没有显著影响，而且应用RGD竞争性多肽Cyclo(RGDf-N(Me)V-)应用进一步确定该结果。而利用荧光素酶报告基因分析表明GD126对外源蛋白表达量的影响依赖于细胞系，进一步表明RGD与外源蛋白表达无直接关系。.高通量的表达谱测序技术对分别含有GD126/SX126病毒感染的细胞样品进行分析发现：在感染后6、12、24h共分别有112、253、380 个基因差异表达，其中差异表达的病毒因子有9、44、67个，其它为差异表达的宿主因子，主要为与蛋白表达相关的核糖体组成蛋白以及核酸结合等宿主因子以及一些信号因子。利用Q-PCR分析证明DNAhel、dnapol等病毒复制必需基因表达被明显推迟。.所以通过本研究表明Bm126中的RGD基序不是病毒增加多角体产量的原因，而表达谱分析证明不同Bm126病毒感染家蚕细胞后病毒基因的复制表达有显著差异，即GD126病毒感染的细胞中病毒基因复制表达被延迟，但具体作用机理有待于挖掘。家蚕细胞抑制推迟GD126病毒复制表达在抗病毒研究中具有重要作用，为家蚕抗病育种以及病毒的潜伏性感染研究提供线索。