肉桂醛抗沙门氏菌III型分泌系统的作用靶标及机制研究

Growing resistance to antibiotics has spread very rapidly, directly affected the control of bacterial infections. Novel therapeutic strategy against bacterial infection has become a focus of global attention. Many studies showed that the type III secretion system (T3SS) and its effectors of Gram-negative bacteria play crucial roles in pathogenic progress. T3SS, an essential virulence element of Salmonella spp., is a source of antivirulence strategies target. Salmonella are the most popular zoonotic pathogen bacteria in global with serious harm to the development of husbandry and the human health. We found that cinnamaldehyde reduced the content of T3SS-mediated secretion proteins in the culture without affecting the growth of bacteria in Salmonella. Cinnamaldehyde also protected mice from Salmonella typhimurium-induced death. Salmonella typhimurium will used in this project. We will study the changes in T3SS-1 effectors amounts and its regulatory gens expression using LC-MS, Western-blot and RT-PCR. These results will illuminate the mechanisms and targets of of cinnamaldehyde inhibited Salmonella T3SS. Cell and animal infection models will use to investigate the protection and treatment effects of Salmonella infection by cinnamaldehyde. This research provides a theoretic basis for the treatment mechanism of cinnamaldehyde used in Salmonella infections, but also provides a new structure for development of T3SS inhibitor.

随着细菌对抗生素的耐药性日益严重，新型的抗细菌感染治疗策略已经成为全球研究热点。研究证明了III型分泌系统（T3SS）及其分泌的效应蛋白在革兰氏阴性细菌致病过程中具有关键作用，并成为抗毒力治疗策略的作用靶标。沙门氏菌是一类常见的革兰氏阴性细菌，为人兽共患病病原。本课题组前期研究发现肉桂醛在不影响沙门氏菌生长的浓度下，可以减少T3SS效应蛋白的含量，也能提高小鼠感染沙门氏菌的生存率。为此，本项目以鼠伤寒沙门氏菌为研究对象，采用LC-MS，Western-blot，RT-PCR等技术，从肉桂醛对沙门氏菌T3SS效应蛋白、效应蛋白编码基因及其调节因子的改变等方面开展研究，寻找肉桂醛的作用靶标，阐明其作用机制。通过建立细胞感染和动物感染保护模型评价肉桂醛体内活性，阐明肉桂醛治疗沙门氏菌感染的机制。为肉桂醛抗沙门氏菌感染的应用提供理论依据，同时为T3SS抑制剂的研发提供候选结构。

沙门氏菌是一种常见的人兽共患病病原，严重影响到畜禽养殖和危害公共安全。随着抗生素的不合理使用和禁抗的全面推进，临床上急需新型的抗沙门氏菌感染的药物和新型治疗策略。本项目在前期试验基础上，研究了肉桂醛体内外对沙门氏菌及其III型分泌系统的作用，同时探讨了沙门氏菌感染雏鸡后宿主发生的反应。结果显示，肉桂醛体外对沙门氏菌的MIC为128-256 μg/mL，其中包括耐药性沙门氏菌。亚抑菌浓度条件下的肉桂醛可以影响到沙门氏菌的细胞膜的完整性、超微结构和蛋白质的代谢。随后通过蛋白质组学的方式深入研究了肉桂醛对沙门氏菌的作用机制，结果显示表达差异蛋白涉及了多种细菌组成、生物过程和分子功能，涉及了50余条对应的细胞通路，主要为细菌的多种代谢酶的合成、氨基酸生物合成和硝基甲苯降解等，结果还显示肉桂醛可以下调沙门氏相关的毒力因子和耐药酶的表达水平。发现肉桂醛可以显著下调III型分泌系统的效应蛋白SipA的水平，通过对其相关调控基因进行研究，发现InvB和多个菌毛调控基因转录水平发生了显著下降。表明肉桂醛直接作用于细胞壁和细胞膜，进入菌体内下调氨基酸合成与代谢，影响细菌的生理代谢，抑制细菌生长；肉桂醛通过下调SipA的分子伴侣InvB的表达影响到SipA的组装和释放，还作用于菌毛调控系统。为了进一步研究肉桂醛在体内抗沙门氏菌感染的作用，我们建立了雏鸡白痢感染模型，结果发现肉桂醛可以减少雏鸡的死亡率，改善病雏鸡的白痢和精神状态等临床症状。当给药剂量为100 mg/kg.bw时，雏鸡的死亡率从75%降到30%；还可以显著改善肛门温度，调正病雏肝脏中ATP含量，血清中AST和ALT的含量在药物处理后显著减低。用药后，鸡肠道沙门氏菌定殖降低，肠道菌群中优势菌群恢复正常；降低肠道相关免疫炎症因子的表达。综上，本研究的开展，初步阐明了肉桂醛对沙门氏菌的作用机制、对III型分泌系统的作用靶标以及对雏鸡白痢的治疗作用，为肉桂醛和相关中兽药防治沙门氏菌病在临床上的使用提供理论依据和实验基础。