单加氧酶可变剪切异构体在aurovertins及其结构类似物生物合成中的功能与催化机制

Though various types of oxidations catalyzed by monooxygenases for biosynthesis of natural products are vital to their structural diversity and complexity, there is no report on the level of mRNA alternative splicing of monooxygenases for their unique enzymatic functions and catalytic mechanisms. Here we will study the efficient epoxidation and hydroxylation catalyzed by three alternatively spliced isoforms of AurC during biosynthesis of aurovertins in the filamentous fungus Calcarisporium arbuscula, and reveal the mechanisms of specific recognition and efficient catalysis by three isoforms on the structurally similar substrates by protein crystallization. Moreover, ctvC, which is the homologous gene for biosynthesis of citreoviridin, the analogs of aurovertins, is artificially engineered by alternative splicing manually based on aurC, to obtain the corresponding CtvC isoforms to further oxidize citreoviridin for new products. Our work will for the first time unveil the mechanisms of highly precise and efficient biosynthesis of natural products because of the enzyme function diversity and specificity, which results from the mRNA alternative splicing, and also provide the basis for biosynthesis of structurally more complex and diverse natural products by manual engineering of tailoring enzymes based on alternative splicing from the point view of synthetic biology.

单加氧酶可催化天然产物生物合成中多种类型的氧化反应，是天然产物结构多样性和复杂性的重要来源，但未有从单加氧酶mRNA可变剪切水平上解析其独特酶学催化功能与机制。本课题研究丝状真菌齿梗孢霉中单加氧酶AurC三个可变剪切异构体在aurovertins生物合成不同阶段高效有序环氧化、羟化的催化功能；通过蛋白晶体结构解析三个异构体蛋白对结构类似底物的特异识别机制，及其高效催化的分子机制；同时基于aurC可变剪切，对aurovertins结构类似物citreoviridin生物合成中单加氧酶同源基因ctvC进行人工可变剪切改造，获得CtvC异构体酶来进一步氧化citreoviridin来生产新化合物。本课题首次揭示可变剪切导致的酶功能多样性和特异性在天然产物生物合成中的精确性和高效性催化机制，并为通过合成生物学理念从可变剪切水平上人工改造修饰酶来获得更多复杂多样天然产物奠定基础。

本项目为了系统研究齿梗孢霉中aurovertin及其结构类似的生物合成机制及合成酶可变剪切，首先对齿梗孢霉的基因组及在PDA培养基上的转录组进行了重新测序和分析。我们发现齿梗孢霉中含有65个基因簇，除了aurovertin基因簇外，其他基因簇的表达都是沉默的，或显著低于管家基因表达水平。我们在齿梗孢霉中建立了农杆菌介导的遗传转化技术，实现了高效的基因高表达、基因敲除、蛋白亚细胞定位等。以上工作为后续可变剪切、细胞工厂构建、合成途径解析奠定了基础。基于项目前期研究基础，我们针对单加氧酶N端区构建了cDNA文库，并通过筛选获得了共6个可变剪切异构体，其中5个为同框。经与aurC缺失株功能互补发现，仅最长的异构体具有多个功能，包括底物的2次环氧和1次羟化反应，实现对aurovertin的全部氧化。同时我们系统评价了齿梗孢霉aurA细胞工厂，发现其具有较好的合成聚酮天然产物的潜力。基于此细胞工厂和AurC功能的多样性，我们成功在齿梗孢霉中实现了aurovertin结构类似物citreoviridin的结构扩展，并结合定向酰化合成，实现了其构效优化，其抗肿瘤活性、药代具有显著提升。我们进一步发现在aurovertin结构类似物asteltoxin生物合成中，环氧水解酶AstD催化了位置特异性、立体选择性的环氧水解，以及lewis酸介导的semi-pinacol重排。该重排是一类重要的有机反应，对构筑天然产物结构复杂性和多样性具有重要意义。目前仅发现9个催化半频哪醇重排的酶，包括8个氧化酶和一个NTF2-家族酶，催化的底物均为生物碱，催化类型也极为有限。本研究发现的重排酶为构筑聚酮类天然产物的结构多样性提供了新的酶工具。本项目相关研究内容共发表7篇论文，发表在ACS Catal, Nat Commun, ACS Synth Biol等杂志上。