冬虫夏草无性型中国被毛孢与珠芽蓼共生体的构建及其基因表达谱分析

Ophiocordyceps sinensis (Berk.) Sung, Sung, Hywel-Jones & Spatafora, an entomopathogenic fungi, is one of the most valuable treatments in Traditional Chinese Medicine and is known for its medicinal properties. The anamorph of O. sinensis is Hirsutella sinensis. The fungus colloquially known as caterpillar fungus is a specific parasite of Thitarodes Viette (syn. Hepialus, Lepidopterra: Hepialidae) larvae, and difficult to infect the host larvae directly in laboratory. However, the culture-independent detection results showed that O. sinensis is an inter-kingdom host jumper between Animalia and Plantae.We found O. sinensis could infect Thitarodes larvae and sybiose with alpine plants. This finding implied the formation process of O. sinensis may highly relative with plants in alpine meadow. Here we plan to find out the different of gene express profile after Ophiocordyceps sinensis symbiose with alpine plant Polygonum viviparum. We would culture O. sinensis and Polygonum viviparum with in vitro dual culture system, and then extract the total RNA of O. sinensis free-living mycelium, symbosis of O. sinensis - Polygonum viviparum samples. And then find out the different transcripts base on Illumina RNA-Seq. Gene ontology (GO) analysis, metabolize pathway map and function annotation of the differentially expressed unigene would be analysed to reveal the mechanisms of O. sinensis - plant interactions. Finally, we would apply RNAi techonology to reveal the function of the key genes. This research will help to find out how the interkingdom host jumping life history effect on the formation of O. sinensis.

冬虫夏草是一种虫生真菌，是我国的传统名贵药材，具有重要的药用和经济价值。长期以来，冬虫夏草无性型中国被毛孢被认为只专性寄生于钩蝠蛾幼虫，申请人最近研究发现冬虫夏草真菌可以与珠芽蓼等多种高寒植物根系共生，具有宿主跨界生活史。已有研究表明真菌在与植物共生时，其关键基因的表达量在共生前后有明显变化，促进共生体的形成。本项目拟采用体外共培养法构建中国被毛孢与珠芽蓼无菌苗（或愈伤组织）的共生体，分别提取中国被毛孢纯培养菌丝、与珠芽蓼组织形成共生体的总RNA，应用转录组测序RNA-Seq及生物信息学分析技术，对共生前后的基因表达谱进行差异基因筛选、GO分类、代谢通路以及功能注释预测，并克隆表达量差异较大的2~3个关键基因，最终通过RNAi技术探讨目标基因的功能，深入研究中国被毛孢与高寒植物的共生生活史及其分子基础。本研究将有助于人们深入了解冬虫夏草形成过程的规律，对冬虫夏草资源可持续利用具有重要意义。

冬虫夏草是我国特色名贵滋补中药材，也是青藏高原中东部农牧民的主要经济来源之一，具有重要的药用和经济价值。珠芽蓼是分布在青藏高原高寒草甸冬虫夏草适生地的代表性植被种类之一，也是冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫的主要食料之一。长期以来，冬虫夏草无性型中国被毛孢被认为只专性寄生于钩蝠蛾幼虫，前期研究发现冬虫夏草菌在珠芽蓼等多种高寒植物根际共生，具有宿主跨界生活史。本项目筛选出利用种子消毒后萌发的方法，获得了珠芽蓼无菌苗，探讨了珠芽蓼无菌苗的培养基种类和培养方法，采用体外共培养法构建冬虫夏草菌与珠芽蓼无菌苗的共培养体，经过PCR检测确认冬虫夏草菌存在于珠芽蓼的根际微生态环境中；将冬虫夏草菌纯培养菌丝及其与珠芽蓼共培养的根系RNA进行了RNA-Seq转录组测序，获得了冬虫夏草与珠芽蓼根系共培养前后的基因表达谱，通过比较分析后筛选出了差异表达基因2366个，其中上调表达基因1042个，下调表达基因1324个，对差异表达基因进行了GO富集分析发现差异表达基因主要为细胞过程以及分子功能相关基因，细胞组成基因较少，其中细胞过程中的“单细胞组织过程”相关基因最多；经KEGG富集分析后发现，发现差异较大的基因主要为次生代谢生物合成相关基因。经诱导表达发酵冬虫夏草菌丝后，通过反转录方法获得了与冬虫夏草菌侵染活性密切关键的多糖酶系基因OCS_00030以及OCS_02998的cDNA，将两种关键酶系基因构建到pET-32a原核表达载体中，并经过体外诱导表达获得了65KD和44KD的蛋白，经过反链RNA抑制发酵中的冬虫夏草菌丝的OCS_00030和OCS_02998的表达，发现经RNAi处理的冬虫夏草菌发酵液提取物不能降解几丁质，推测OCS_00030和OCS_02998基因是冬虫夏草菌侵染寄主昆虫时瓦解昆虫表皮第一道防御的关键酶基因，冬虫夏草菌在与高寒植物珠芽蓼共生过程通过调节OCS_00030和OCS_02998等多糖酶系基因表达提高自身的侵染活性，本项目的研究结果从分子转录水平增加了人们对冬虫夏草菌在高寒植物根际共生过程的认识，对提高冬虫夏草产业化效率以及促进冬虫夏草资源的可持续利用具有重要意义。