促性腺激素受体介导的PKA信号通讯调控大菱鲆卵子发育机理

Egg development in fish is under control of complex regulatory mechanisms involving both extrinsic and intrinsic signalling pathways. In the case of signalling pathways, local signal communication within egg cells, appears to play critical roles in controlling development of different cells. The effect of gonadotropin receptors(GtHRs)-mediated PKA signal communication on development of turbot eggs was evaluated and involved signalling pathways as well as oocyte, granulosa cells and theca cells interaction were investigated in oocyte microenvironment. In this study, the spatiotemporal experssion patterns of GtHRs were assessed after we obtain the coding region. In addition, the changes of gap junctions and extracellular matrix within the egg and its role in regulating cell development were evaluated, together with the underlining mechanisms. Furthermore, the effect of GtHRs-mediated PKA signal communication on egg selection and atresia were identified and characterized. These studies reveal the regulation of GtHRs-mediated intercellular signal communication on egg selection, atresia, maturation, nutrients transport and other key physiological aspects in oocyte microenvironment of turbot (Scophthalmus maximus), further elucidate internal physiological mechanism in teleosts, thus providing the theory basis for fish breeding in marine aquaculture.

鱼类卵子发育是一个复杂的动态生理过程，受到内外源信号通路协同调控，其中卵子内细胞间的局部信号通讯对各类细胞的发育起着极为重要的协调作用。本课题拟以大菱鲆卵母细胞微环境中促性腺激素受体(gonadotropin receptors，GtHRs)介导的PKA信号通讯为核心，以卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞之间互作为主线，获取GtHRs编码基因，查明其时空表达规律，阐明卵子发育过程中细胞外基质和间隙连接的变化及其对卵子内各级细胞发育的调控作用，认识GtHRs对PKA信号通讯媒介作用及其对卵子选择和闭锁影响。以上研究有助于揭示大菱鲆等海水硬骨鱼类卵母细胞局部微环境中GtHRs介导的细胞间信号通讯对卵子选择、闭锁、成熟和营养物质的转运等关键生理环节的调控作用，为完善海水养殖鱼类种苗生产技术提供理论依据。

鱼类卵子发育是一个复杂的动态生理过程，受下丘脑-垂体-性腺轴精微调控，其中垂体分泌促性腺激素通过其受体介导的PKA信号在生殖调控中起着非常重要作用。本研究通过兼并引物扩增及RACE技术，克隆获取了与大菱鲆卵母细胞发育密切相关的促性腺激素受体基因-促黄体激素受体（LHR）和促卵泡激素受体（FSHR），结果表明LHR基因序列全长3184bp，编码685个氨基酸，FSHR基因序列全长3284bp，编码733个氨基酸，系统发育分析表明大菱鲆FSHR和LHR基因同大西洋庸鲽同源性最高。氨基酸序列分析发现LHR和FSHR基因编码蛋白为疏水性蛋白，存在18个氨基酸信号肽序列和典型糖蛋白激素受体跨膜结构域。组织表达分析表明，FSHR和LHR除在卵巢大量表达外，在其他非性腺组织也有表达，尤其是在肝脏表达较高。在卵母细胞发育过程中，从卵黄生成前期至卵黄生成核迁移阶段，FSHR表达呈逐渐上升趋势，且在卵黄生成后期（late vitellogenesis）表达量最高，而LHR在卵黄生成的核迁移阶段（Migratory nucleus stage）表达量最高，排卵后卵巢闭锁阶段（Atresia stage）FSHR和LHR表达量皆降至最低。在卵母细胞发育过程中，间隙连接蛋白43（Cx43）在卵黄蛋白合成后期其转录水平达到最高，而纤粘连蛋白（Fn）则没有发生显著差异变化。蛋白激酶信号检测表明，在卵子发育过程中，PKC在各级细胞上无表达分布，而PKA在卵黄合成后期卵泡膜层细胞表达，此时FSHR在膜层细胞的表达也显著增高。将LHR和FSHR通过脂质体2000转染HEK293T细胞，通过外源性激素刺激检测转染后细胞内第二信使cAMP的含量，验证其生物学功能，发现FSHR可被羊源性FSH激活，而羊源性LH则无显著激活作用。以上结果表明，大菱鲆FSHR和LHR基因属于典型的G蛋白偶联受体，同大西洋庸鲽同源性最高，作为生殖轴调控关键基因，在卵母细胞发育过程中，FSHR可与异源性配体特异性结合，提高细胞内第二信使cAMP浓度，激活PKA，对卵母细胞和滤泡膜细胞的发育成熟起重要调控作用，相关研究丰富了鱼类促性腺激素受体生物学研究内容，同时为大菱鲆等养殖海水鱼类标准化苗种生产提供基础数据和理论依据。