牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗与重组腺病毒疫苗的免疫保护作用及其机制研究

新孢子虫病是危害养牛业生产的重要寄生虫病，目前对该病的防控尚无有效方法。本研究以牛源犬新孢子虫吉林株为试验材料，SOE-PCR拼接NcSRS2和NcGRA7基因，构建NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗和重组腺病毒疫苗；应用prime-boost免疫策略和单疫苗分别肌注接种BABL/c小鼠，ABC-ELISA检测IgG1、IgG2a及IgE等水平,流式细胞术检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群变化，ELISA检测IFN-γ、IL-4等细胞因子水平及血清NO浓度，评价免疫应答水平；对三免后BABL/c小鼠腹腔攻击犬新孢子虫速殖子，观察临床症状并统计存活率，Real-time PCR检测脑组织、脏器等虫体DNA含量，病理学检查脑组织、脏器及生殖器官变化，并检测其生殖机能，评价各组疫苗的免疫保护性，进而阐明免疫保护作用机制。以期为新孢子虫病新型疫苗的研究及该病的防制奠定基础。

新孢子虫病是危害养牛业生产的重要寄生虫病，为阐明牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗与重组腺病毒疫苗的免疫保护作用机制，项目组圆满完成了6项计划研究内容，并进行了拓展研究。本项目应用SOE-PCR技术获得大小为1482 bp的NcSRS2-NcGRA7复合基因；制备了牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7重组蛋白多克隆抗体和pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗；构建了pCR259-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒表达质粒，制备了滴度为10^9 TCID50/mL的Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗；应用核酸疫苗和重组腺病毒疫苗建立了Prime-Boost免疫策略，经对Prime-Boost和单疫苗接种小鼠的抗体水平、T淋巴细胞亚群变化及细胞因子水平等指标的检测分析，证实Prime-Boost诱导小鼠的免疫应答水平显著优于重组腺病毒疫苗和核酸疫苗；经对攻虫小鼠的临床症状观察，主要脏器组织虫体含量、病理学变化及其生殖机能等各项指标的检测表明，Prime-Boost和Ad5-NcSRS2-NcGRA7免疫保护率最高，pVAX1-NcSRS2-NcGRA7次之；证实Prime-Boost和Ad5-NcSRS2-NcGRA7在提高机体免疫水平的同时，有效抑制了虫体对脏器组织细胞的侵袭，尤其Prime-Boost免疫保护作用优势显著。同时，本项目构建了牛源犬新孢子虫NcSRS2、NcSAG1基因重组腺病毒疫苗，制备了NcMAG1-IFN-γ融合基因核酸疫苗和NcAMA1重组蛋白亚单位疫苗；成功从流产胎牛脑组织中分离出牛源犬新孢子虫延边株；建立了犬新孢子虫Nc-GFP株BALB/c小鼠动物模型和犬新孢子虫三种靶基因PCR检测方法；对牛源犬新孢子虫NcSRS2、NcAMA1、NcSRS9、NcGRA7等基因进行了克隆和表达；构建了犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒和重组猫疱疹病毒I型转移质粒，并进行了真核表达。本项目为新孢子虫病新型疫苗的临床应用及该病的防控研究奠定了基础。